Marc145细胞培养和维持有关资料综述

1、Marc145细胞培养和维持有关资料综述北京清大天一生物技术有限公司一、细胞及培养1. Marc145细胞上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA104细胞）克隆而得到，可连续培养。2. 生长培养基DMEM（高糖型，含4500mg/LD葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）+5%10%新生牛血清+1%双抗（青霉素和链霉素）的培养液。3. 冻存液生长培养基+10%DMSO4. 细胞健康生长的几项注意事项1）细胞没有支原体等外源因子的感染。2）培养液的pH值可在7.0-7.3,以7.2为佳。3）一般按1：3传代，细胞接种密度为11.5105cells/ml,48hr后长成

2、单层。4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。6）细胞传代时消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化过程应尽量缩短在12分钟内完成。二、病毒感染、维持和收获转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37C吸附1hr,加入维持液，置37C恒温室转瓶机上旋转培养35天。维持液：DMEM+45%新生牛血清。pH应为7.47.8;后期维持pH会，曼慢降下来。细胞病变时间出现在接毒后48小时，7296小时细胞病变达80%左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过

3、几代后病变时间可缩短。第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80%时收获病毒，20C冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。收液时需要将含毒细胞反复冻融23次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。三、细胞病变（CPE）细胞在接种病毒后，2448hr开始出现病变，72-96hr约达到80%病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图1是长成单层的marc145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc145细胞。图1健康的Marc145细胞图2图3图4图2、图3和图4均是出现CPE的Marc145细胞四、PRRS病毒在细

4、胞中增殖规律(VirologyJournal,2006,3:90)PRRS病毒感染Marc145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的2022hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc145细胞对PRRS病毒的低感染性(lowpermissiveness)与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性(PRRSV-positive)。第二阶段：感染后的23天(也称为病毒的对数感染期)，病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感(CellsisnonpermissivetofreeVirus)，并出现了感染细胞群。感染过程如图5所示。对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell;同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2-4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。ABCD图5荧光抗体染色显微法观察