第6章_常用分子生物学技术

1、第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。起来的一项高新技术。是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效和高通量样品检测。因该技术常过检测杂交信号

2、实现快速、高效和高通量样品检测。因该技术常用玻片或硅片等材料作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算用玻片或硅片等材料作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片。其原理也是分子杂交机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片。其原理也是分子杂交技术。技术。蛋白质芯片蛋白质芯片（protein chip）, 又称蛋白质微阵列，又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基，将其有序地固定在是指以蛋白质或多肽作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧质或其它分子与

3、之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。用关系。 蛋白质芯片技术在医学中的应用蛋白质芯片技术在医学中的应用特异性抗原抗体的检测特异性抗原抗体的检测 生化反应的检测生化反应的检测 疾病诊断疾病诊断 对疾病分子机制的研究对疾病分子机制的研究 药物筛选及新药的研制开发药物筛选及新药的研制开发 又称细胞微阵列，是以活细胞为研究对象的一种生又称细胞微阵列，是以活细胞为研究对象的一种生物芯片，在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、物芯

4、片，在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、运输、刺激及培养的精确控制，并通过微型化的化运输、刺激及培养的精确控制，并通过微型化的化学分析方法，实现对细胞样品的高通量、多参数、学分析方法，实现对细胞样品的高通量、多参数、连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等。连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等。 组织芯片组织芯片, 又称组织微阵列，是将不同生物体的组又称组织微阵列，是将不同生物体的组织按预先设计或研究需要排列在固相载体上所形成织按预先设计或研究需要排列在固相载体上所形成的组织微阵列。的组织微阵列。组织芯片最大的优势在于可以对大量组织标本同时组织芯片最大的优势在于可以对大量组织标本同时进行检测

5、，只需一次实验过程即可完成，缩短时间，进行检测，只需一次实验过程即可完成，缩短时间，减少误差，提高了可比性。减少误差，提高了可比性。 （一）PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物

6、酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70

7、年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR耐热DNA聚合酶的应用，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryKary Mullis Mullis “ “我不大喜欢动手我不大喜欢动手, ,我宁肯不动手我宁肯不动手, ,我不喜欢做费力的事。作为一个发明家我不喜欢做费

8、力的事。作为一个发明家, ,重要的一点是为重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案。解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案。” ” 1）模板）模板DNA2）特异性引物）特异性引物3）耐热）耐热DNA聚合酶聚合酶4）dNTPs5）Mg2+6）缓冲液）缓冲液 模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95507

9、2TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束 一个一个生物体生物体的的基因组基因组DNA用用限制性内切酶限制性内切酶部分酶切后，部分酶切后，将酶切片段插入到载体将酶切片段插入到载体DNA分子分子中，所有这些插入了基因中，所有这些插入了基因组组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库基因文库(gene library)。 cDNA文库是以特定的组织或细胞文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转为模板，逆转录形成的互补

10、录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包克隆群，这样包含着细胞全部含着细胞全部mRNA信息的信息的cDNA克隆集合称为该组织或细克隆集合称为该组织或细胞的胞的cDNA文库。文库。 cDNA文库具有组织或细胞特异性文库具有组织或细胞特异性。 cDNA文库显然比文库显然比基因组基因组DNA文库文库小得多，能够比较容小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。 1）制备靶基因的核酸探针）制备靶基因的核酸探针2）若靶基因表

11、达蛋白已知，可反推部分基因序列，制备寡核苷酸探针）若靶基因表达蛋白已知，可反推部分基因序列，制备寡核苷酸探针3）差异显示杂交）差异显示杂交 利用核酸分子杂交分离目的基因：利用核酸分子杂交分离目的基因： 差异显示杂交不需要核苷酸序列信息，而耍拥有两种不同的细胞群体：目的基因正常表达细胞群和在基因不表达细胞群。制备两种不同mRNA提取物，一是含有目的基因mRNA的总mRNA群体，一是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。因此，可以通过这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重

12、组体的菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片井对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。 1）在基因组水平上研究某基因对器官、组织和细胞在个）在基因组水平上研究某基因对器官、组织和细胞在个体发育中的影响体发育中的影响2）cDNA文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊组织基因的制备殊组织基因的制备3）由于每一个）由于每一个cDNA克隆都包含一种克隆都包含一种mRNA序列，这样序列，这样在筛选中出现假阳性的概率就会很低

13、在筛选中出现假阳性的概率就会很低4）为了测定）为了测定mRNA序列，利用它的序列，利用它的cDNA拷贝序列就可拷贝序列就可以有效分析外显子的基因结构以有效分析外显子的基因结构化学合成法主要应用1.作为核酸分子杂交探针作为核酸分子杂交探针2.作为引物，用于测序和作为引物，用于测序和PCR3.用于制备小的基因、不易获得基因或用于改造天用于制备小的基因、不易获得基因或用于改造天然基因然基因4.作为作为DNA末端改造中的接头末端改造中的接头5.用于制备用于制备cDNA，筛选克隆基因，或基因定位或，筛选克隆基因，或基因定位或基因的定点突变基因的定点突变利用胚胎干细胞进行基因敲除。利用胚胎干细胞进行基因敲

14、除。1）构建常规基因敲）构建常规基因敲除载体，载体中的外源基因与靶基因高度同源，且被修饰除载体，载体中的外源基因与靶基因高度同源，且被修饰和改造；和改造；2）敲除载体质粒导入胚胎干细胞；）敲除载体质粒导入胚胎干细胞；3）筛选发生）筛选发生同源重组同源重组的阳性胚胎干细胞；的阳性胚胎干细胞；4）通过显微注射将阳性胚胎）通过显微注射将阳性胚胎干细胞导入胚囊；干细胞导入胚囊；5）转入假孕雌鼠子宫；）转入假孕雌鼠子宫；6）获得嵌合体）获得嵌合体小鼠。小鼠。 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3

15、5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 knock-out ：the gene of interest is disrupted 同源重组同源重组抗性选择抗性选择WaxyWaxyWaxyWaxyWaxyWaxy表达载体受体基因组打靶结果质粒筛选抗性基因质粒筛选抗性基因：AmpR，KanR阳性筛选基因表达阳性筛选基因表达：转染后的细胞存活，最多见Neo阴性筛选基因表达阴性筛选基因表达：转染后的细胞死亡，DTA， HSV-TK 原核显微注射ES细胞入胚胎通常用的是细胞入胚胎通常用的是E3.5的囊胚，进行的是囊胚显微注射，得到的囊胚，进行的是囊胚显微注射，得到的是嵌合体小鼠的是嵌合体小鼠思考题思考题1.核酸分子杂交技术分为哪几种类型？各自特点？核酸分子杂交技术分为哪几种类型？各自特点？2.什么是探针？什