稳定性同位素讲座ppt课件

1、稳定 性同位素在发酵过程工艺优化研讨中的运用13C MFAA Powerful Tool in Metabolic Engineering概念原理实验设计运用消费过程中广泛存在的问题：1 发酵消费中底物糖、前体等耗费较大呵斥发酵原资料本钱较高，如青霉素、头孢、环保菌素、维生素发酵等。2 发酵消费过程中副产物的组分含量较高，如谷氨酸发酵过程中乳酸的积累、维生素B12发酵过程中丙酸积累。3 发酵产物合成途径的分析，初级代谢与次级代谢之 间的关系。4 发酵产物合成过程中，哪些物质或条件可以促进产物的合成，其作用的原理是什么。 菌种菌种中试中试小试小试生理特性研讨生理特性研讨宏观过程参数分析宏观过程参

2、数分析微观代谢流分析微观代谢流分析消费放大消费放大多尺度相关分多尺度相关分析和差别分析析和差别分析微型传感微型传感反响器反响器流膂力学分析流膂力学分析基于化学计量学的代谢通量分析常规基于化学计量学的代谢通量分析常规MFA 基于化学计量学的基于化学计量学的MFA即常规即常规MFA，其实际根底是中间代谢物的拟稳态假设和，其实际根底是中间代谢物的拟稳态假设和物料的质量守恒定律。它是在构建好的细胞代谢网络的根底上，先假设代谢网络物料的质量守恒定律。它是在构建好的细胞代谢网络的根底上，先假设代谢网络的中间代谢物都处于拟稳态，然后根据物料质量守恒定律写出符合该代谢网络的的中间代谢物都处于拟稳态，然后根据物

3、料质量守恒定律写出符合该代谢网络的化学计量矩阵方程，再经过丈量胞外底物耗费速率和代谢物分泌速率，最后计算化学计量矩阵方程，再经过丈量胞外底物耗费速率和代谢物分泌速率，最后计算得出整个代谢网络的流量分布。得出整个代谢网络的流量分布。 可逆反响、平行反响、无效循环以及回补反响等，严重影响着发酵过程代可逆反响、平行反响、无效循环以及回补反响等，严重影响着发酵过程代谢产物的生物合成过程，谢产物的生物合成过程，基于碳标志实验基于碳标志实验CLE的代谢通量分析的代谢通量分析13C-MFA 该方法运用某个特定位置被标志的底物分子，或者用部分标志及部分未标志的该方法运用某个特定位置被标志的底物分子，或者用部分

4、标志及部分未标志的混合底物培育微生物；细胞摄取标志底物后，经过体内一系列的代谢反响，底物混合底物培育微生物；细胞摄取标志底物后，经过体内一系列的代谢反响，底物的标志信息在代谢过程中经过中间代谢途径被转移到中间代谢产物上，代谢途径的标志信息在代谢过程中经过中间代谢途径被转移到中间代谢产物上，代谢途径的不同就会引起中间代谢物碳骨架标志碳原子的丰度不同，用的不同就会引起中间代谢物碳骨架标志碳原子的丰度不同，用GC-MS或或NMR可以丈可以丈量出中间代谢物的标志信息，该信息可以用来进展代谢途径通量的分析；这种方量出中间代谢物的标志信息，该信息可以用来进展代谢途径通量的分析；这种方法逐渐得到扩展和修正，

5、曾经走向成熟化，成为国际上代谢工程研讨和运用的热法逐渐得到扩展和修正，曾经走向成熟化，成为国际上代谢工程研讨和运用的热点。点。 原理 13C MFA代谢通量分析 该方法主要基于延续培育的拟稳态，将微生物在有特定标志碳源底物的培育基中培育，标志碳原子就会分布到整个代谢网络，13C标志的底物通常为葡萄糖被引入 生 物反响体系中，随着生化反响的发生，经化学重排、化学 键的断裂及新化学键的 生成，13C原子将分布于代谢网络、胞内代谢物及生物量组成之中，直至整个系统处于同位素平衡形状； 这时稳态的菌体蛋白水解得到的氨基酸的同位素碳原子的标志丰度可以用NMR或MS进展检测，由氨基酸的标志信息根据同位素的质

6、量分布向量平衡，可以进一步得到中心代谢碳骨架有机酸的标志信息，这些碳原子的同位素标志信息可以用于分析和计算代谢途径的通量信息。这种方法可以对传统代谢流计算中不能分析的双向代谢反响、回补途径和反向代谢途径进展测定。 在非稳态过程中进展标志实验时，可经过胞内游离的氨基酸的标志信息来进展代谢流的通量计算。Figure 5. Network representation of the partial measurements for the medium-size E. coli network (Antoniewicz et al., 2019c). Panel (A) shows the bios

7、ynthesis of eachamino acid whose fragment MDVs were measured. Source metabolites are circled, and the measured product (PDO) is boxed by a solid line. Measured amino acids are also boxed by solid lines and their direct carbon sources are indicated by dotted arrows. Some metabolites (in dotted square

8、s) appear more than once to make the figure more readable. Panel (B) shows the complete set of alternatives for the two partial measurements (22 combinations in total) required in addition to the suggested core measurements. Only amino acid pairs connected with a line are valid measurement choices.

9、Color figure can be seen in the online version of this article, available at interscience.wiley.SER0000100010001101110111021113nnnimtnmmccccmmcccmcmThe fractional labeling of each fragment was calculated 氨基酸衍生物碎片质量同位素丰度信息m0m1m2m3m4m5m6m7m8m9m10Ala-570.580.200.100.12Ala-850.610.210.18Ala-1590.650.180

10、.17Gly-570.720.170.11Gly-850.790.21Val-570.480.200.150.110.040.02Val-850.490.220.200.060.03Val-1590.550.190.180.050.02Val-f3020.620.210.17Leu-850.440.230.200.080.040.01Leu-1590.480.220.190.070.030.01Ile-850.450.240.190.080.030.01Ile-1590.500.220.180.060.020.01Pro-850.530.250.160.050.020.00Met-570.51

11、0.250.160.08Met-850.560.260.17Met-1590.650.240.14Ser-570.570.220.130.08Ser-850.590.250.16Ser-1590.650.220.13Ser-f3020.660.180.15Thr-570.450.260.160.090.03Thr-850.480.280.170.07Phe-570.380.150.120.140.090.050.030.020.010.01Phe-850.390.160.170.110.080.050.030.010.00Phe-1590.430.140.170.100.080.040.030

12、.010.00Asp-570.440.260.170.100.04Asp-850.470.280.180.07Asp-1590.520.270.160.06Asp-f3020.600.240.16Glu-570.410.260.190.090.040.01Glu-850.440.270.190.070.03Glu-1590.490.260.170.060.02Glu-f3020.600.280.12Lys-570.380.240.180.110.050.020.01His-570.430.230.130.090.050.050.02His-1590.470.220.160.070.060.02

13、His-f3020.590.240.18Tyr-570.320.170.130.140.090.060.040.020.010.010.00Tyr-1590.360.160.180.110.090.050.030.010.010.00Tyr-f3020.640.170.19 实验设计实验设计 对该菌的代谢途径有一定的了对该菌的代谢途径有一定的了解。解。 合成培育基的选择。合成培育基的选择。 标志底物的选择。标志底物的选择。 标志底物标志底物 方式的选择。方式的选择。 取样时取样时 间点的选择。间点的选择。Production reactor systemOff gas analysis sys

14、temSensor reactor systemGC-MS analysis system 运用实例 某发酵过程中甜菜碱代谢作用分析 7-ADCA发酵过程中己二酸前体的利用A 某发酵过程中甜菜碱代谢作用分析MVAglyt= fMVAglybet+(1-f )MVAser1-2 实验设计： 用全标志的葡萄糖和没有标志的天然甜菜碱，零售酵培育，定时取样分析菌体组成氨基酸的标志丰度变化。 添加时间（h）添加量（g/l）control015.0run-107.0run-2247.0run-3427.0run-4547.0run-5667.0run-6727.0204060801001200510152025DCW (g/l)Time (h) control run-1 run-2 run-3 run-4 run-5 run-6control run-1