酶促反应动力学实验

1、酶动力学综合实验实验碱性磷酸酶 Km值的测定【目的要求】1. 了解底物浓度对酶促反响速度的影响2了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求 Km值的方法。【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、 骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性 磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。2、米氏方程：Michaelis-Menten在研究底物浓度与酶促反响速度的定量关系时，导出了酶促反 应动力学的根本公式，即：式中：v表示酶促反响速度,咯磁表示酶促反响最大速度,S表示底物浓度, 兀?表示米氏常数。3、值的测定主要采用图解法，有

2、以下四种: 双曲线作图法图1-1, a根据公式1，以v对s作图，此时1/2匚心时的底物浓度s值即为Km值，以 克分子浓度M丨表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓 度很难使酶到达饱和。实测 论严卫一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v 对S的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。 Lin eweaver- Burk作图法双倒数作图法图 1-1，b实际工作中，常将米氏方程式1作数学变换，使之成为直线形式，测定要 方便、精确得多。其中之一即取1式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式:以对一作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为二，纵截距为。把直线外推与& 侍

3、 ciuJ mu横轴相交，其截距相交，其截距即为一 Hofstee作图法略 把2式等号两边乘以迖心，得:v =+ Vmaxvv以V对一作图，这时斜率为，纵截距为.，横截距为：。 Han as作图法略把2式等号两边乘以S,得:以一对s作图，这时斜率为，纵截距为* IT13JC咗E匸本实验主要以双倒数法，即 Lin eweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶 Km值。 具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯 二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下，和 60C，准确反响13分钟。在碱性条 件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长 620nm比色。在一定条件下

4、色泽深 浅与光密度成正比。反响式如下：然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反响速度， 即以光密度的倒数作纵坐 标，以底物浓度的倒数作横坐标，按 Lin eweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶 Km值。【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴2. 721型分光光度计试剂：1. 酚试剂：称钨酸钠一Wl. 20100g,钼酸钠一Mo 2 O 25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL,85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。 充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出，再参加硫酸锂LiSO4 150g,蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风 橱中开口煮沸15

5、min，以除去多余的溴。冷却后定容至 1000mL，过滤即成， 此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。假设此贮 存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可 继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。2. 磷酸苯二钠基质液：称取 625mg磷酸苯二钠C6H5PO4Na22H2O，溶于 1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保 存一年之久。3. 碱性缓冲液：称取无水碳酸钠及碳酸氢钠，溶解于蒸馏水中，并稀释至 1,000ml.4. 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶 1mg,加水34ml，冰箱内可保存五周左右。 【实验步

6、骤】取6支试管按下表参加试剂:123456磷酸苯二钠ml蒸馏水ml-碱性缓冲液 ml混匀后，60r欲温5分钟碱性磷酸酶液-ml、八亠、八 注意:混匀后，60E水浴13分钟准确计时1参加碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加2此比时为酶促反响，总体积 3第六管不加酶。酚试剂ml10%Na2CO3(ml )混匀后，室温放置15分钟注意：1酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故参加酚试 剂后酶促反响即停止。2Na2CO3提供碱性环境，参加 Na2CO3后试剂才显色以6管为调零点，在620nm波长处比色【结果处理】1将各管光密度和底物浓度记入下表管号S1/S123452以为纵坐标，1/s为横坐标，按Lin

7、eweave卜Burk作图，求出碱性磷酸酶的 Km 值。【考前须知】1参加碱性磷酸酶的量要准确2保温时间要准确准确保温的方法：从第一管参加酶液开始计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液，直至加完，至V准确13分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反响，并每隔 1 分钟向下一只试管加酚试剂，直至加完止，这样保证每管准确保温 13分钟。【思考题】1Km的意义及其影响因子2为什么酶促反响速度以初速度表示3为什么可直接代替V作图4分析自己的实验数据实验二一一温度对酶活性的影响【实验目的】了解温度对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性的认识。 【实验原理】每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低

8、。 一般而言，假设 酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而假设处于极低温度的环境中 只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或局部的恢复其活性。【仪器与试剂】仪器：1 冰箱2.恒温水浴锅3.试管和试管架4 吸量管及吸量管架5.移液枪及枪头6.胶头滴管7 烧杯试剂：1. 的缓冲液：量取的磷酸氢二钠和的柠檬酸混合摇匀即可。2 . 0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：可溶性淀粉和氯化钠，溶于100ml蒸馏水 需加热。3. 0. 03175g/L 碘液4. 1M HCl溶液5.1M NaOH溶液6.稀释100倍的唾液7.冰水浴【实验步骤】1. 制管和预温由于本实验对恒温反响要求较高，故每个

9、温度梯度使用两支试管，分别标记 为A管和B管，同时欲温底物与酶。A管参加的缓冲液和0.5%淀粉液；B管使用 移液枪参加稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温 5min。 取12支洁净试管，参照下表参加试剂：管号1 0C2室温3 37C4 50C5 70C6室温A的缓冲 液ml222222含 NaCl 的 0.5% 淀粉液ml22222用2ml的蒸馏 水代替B稀释100倍的唾 液ml111111*6号管为对照组比色时作为0号管，置于室温，且淀粉液用蒸馏水代 替2 .混合A B管将1号A管试剂迅速参加温度对应的B管中为了最大限度保证酶的量，此 时为计时的起点使用秒表，摇匀后放回对

10、应温度继续水浴。注意：转移 A管 试剂前需将其摇匀。3. 时间控制然后每隔1min或2min时间自定按上步操作依次把 2、3、4、5、6号的 A、B管混合，严格控制好时间。4. 中止反响准确反响13min,向1号管参加2滴1M HCl溶液，立即混匀，中止反响， 按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架。后再各用滴1M NaOHS液中和每管。5显色 在每管中各参加碘液并混匀，观察现象。6比色 假设不同温度梯度间现象差异不明显，那么进行比色，通过光密度值来比拟。【结果处理】 记录现象或比拟吸光度值 ，做出合理分析。【考前须知】严格注意时间的控制及各物质的添加量。【思考题】如果某同学

11、 没有严格按照教案步骤 做出的实验结果为唾液淀粉酶的最适温度 为 70 度，请分析他得出这样的结果的可能原因。实验三 PH 对酶活性的影响【实验目的】了解PH对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】对酶活性影响的机理：PH影响酶活性中心的某些必须基团的解离，而这些基团 往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大催化活性； PH 影响可 解离基团的底物和辅酶的荷电状态，从而影响酶对他们的亲和力；PH还可以影响 酶活性中心的空间构象 , 从而影响酶的活性。2. 本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受 PH的影响的情况。淀粉在该酶 的催化作用下会随着时间的延长而出现不同

12、程度的水解 , 从而得到各种糊精乃至 麦芽糖 , 少量葡萄糖等水解产物。碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反响呈现 不同颜色,即淀粉蓝色 、紫色糊精 紫色 、红色糊精 红色 、麦芽糖及少量葡 萄糖 黄色 。【仪器与试剂】仪器：1 、冰箱2、电炉3、恒温水浴锅4、试管架及试管5、移液管架及移液管试剂：1、磷酸氢二钠溶液：称取含 2 个结晶水的磷酸氢二钠，用水定容至 1L。2、 柠檬酸溶液：称取含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1L。3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释 10倍、50倍和 100 倍，得三种不同浓度 的酶液、4、0.5%淀粉的 0.5%氯化钠溶液：可溶性淀粉和氯化钠，溶于 100ml 蒸馏

13、水需加热。5、0.1%淀粉液：可溶性淀粉，加到 100ml 蒸馏水中，加热溶解。6、碘液： 15g 碘化钾和碘， 加少许水使碘完全溶解后， 再用水稀释至 200ml 。7、1%氯化钠溶液。& 0.1%硫酸铜溶液。【实验步骤】一PH对酶活性的影响1编号和加试剂:1、缓冲溶液的配制 取六只洁净的三角烧瓶，按表表1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制取六支洁净试管，编号后按表 2操作：表2 pH对酶活性的影响三角烧瓶号123456PH值磷酸二氢钠ml柠檬酸ml【结果处理】记录现象或比拟吸光度值，做出合理分析管号123456PH值缓冲液量ml333333含Nacl的0.5%淀粉ml222222稀释100倍唾

14、液ml222222充分摇匀，37C水浴保温，严格控制时间5min后，立即向各管参加碘液碘液滴333333充分摇匀，观察各管颜色差异【考前须知】充分摇匀，严格控制时间。【思考题】酶的最适PH值受哪些因素影响?实验四酶浓度对酶活性的影响【实验目的】了解酶浓度对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】在适宜的条件下，假设反响物浓度大大高于酶浓度时， 反响速度随酶浓度增 加而增加，两者间成正比。但假设反响底物浓度较低，而且酶的浓度足够高时， 增加酶浓度，反响速度根本不变。本实验采用唾液淀粉酶为例。参加不同浓度的酶，并比拟在同一适当时间后， 以碘检验淀粉的含量从而确认其反响程度。【仪

15、器与试剂】仪器：1. 恒温水浴锅2. 吸量管3. 试管与试管架试剂：1. 含NaCI的0.5%淀粉液2. 的缓冲液3. 分别稀释过10倍、50倍和100倍后的唾液【实验步骤】1.取3支洁净试管，按下表参加淀粉液，缓冲液，加毕放入 37度恒温水浴 锅中保温5分钟；2.保温后，快速参加不同浓度的稀释唾液，摇匀，立即放入37度恒温水浴中，并计时。约3至4分钟后参加等量碘液一至两滴，立即摇匀后，记录各管 的颜色。管号含NaCI的0.5%淀粉液/mL的缓冲液/mL稀释唾液/mL颜色10倍50倍100倍132123213321【结果处理】记录现象，做出合理分析【思考题】实验五一一离子对酶活性的影响【实验目

16、的】了解离子对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。其它的阴离子，女口 Br-、N03-和I-对该酶也有激活作用，但较微弱。而 Cu2+ 对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。就本实验，低浓度CI-可以增加酶活性，高浓度的 CI-或者低浓度的Cu2+那么 会抑制酶活性，同时低浓度的 Na+、SO42-等对酶活性没有影响。激活剂的作用 机制是多种多样的，可能是作为辅酶或辅基的一个组成局部， 也可以直接作为酶 活性中心的构成局部。【仪器与试剂】仪