野外采样实验

1、野外取样实验方案 202204 1. 实验目的研究自然条件下东南景天不同生育期间，其内生菌多样性的动态变化。2. 实验设计选择在东南景天的 苗期、开花期、成熟期 ，于浙江衢州铅锌矿山采集具有代 表性 5 个样点的超累积生态型东南景天， 混合为一个样品并将其连同根际土壤放 入无菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鲜活状态，带回实验室，然后进行 后续处理。3. 实验内容 1 powersoil 试剂盒提取根际土壤菌 DNA 2 可培养植物内生菌别离 3 CTAB 法提取植物内生菌 DNA 4 植物重金属含量测定 5 土壤理化性质测定实验一 powersoil 试剂盒提取根际土壤菌 DNA1. 实验

2、目的powersoil 试剂盒提取根际土壤菌 DNA ，保存，待之后送检2. 实验步骤 1 获取东南景天根际土壤小心把东南景天从土壤中取出， 用镊子夹取粘附在根表的土壤。 每个样点夹 取约3g 土壤，取1g立即提取DNA，余下装入封口袋，？-20C保存。取出的东南景天外表洗净， 晾干。测量鲜重后， 杀青，烘干。测量干重后， 研磨，待测。植物重金属含量， 3个重复，每个重复，共需要植物根茎叶鲜重各 5g2选取 Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad,CA试剂盒提取土壤样品DNA。具体操作步骤如下：1

3、称取约0.25g 土壤样品，放入研磨珠套管PowerBead TubeS，涡旋混匀。 2套管中参加60卩IC1溶液裂解缓冲液，颠倒数次，涡旋5s混匀。3将套管放入水平涡旋振荡仪，在最大速度振荡 10min。4取出套管，在室温下10000 >g离心30s。5把上清液约400500小转移到新的2mL离心管。6加250卩IC2容液抑制物去除液至离心管中，涡旋 5s, 4C下放置5min , 在室温下 10000>g 离心 1min。7将上清液转移到另一新的2mL离心管，总体积不超过600卩,1同时防止吸出 沉淀物。8加200卩I C3§液抑制物去除液至离心管中，涡旋混匀，4C下

4、放置5min, 在室温下 10000>g 离心 1min。9将上清液转移到另一新的2mL离心管，总体积不超过750卩,1同时防止吸出 沉淀物。10加1.2mL C4溶液高盐溶液至离心管中，涡旋混匀，从离心管中抽取约650卩溶液至离心过滤管Spin FilterL11在室温下10000 离心1min，取出管中过滤柱，弃去液体，过滤柱放回管 中。12参加第10步离心管中约650卩溶液，重复第(11)步操作，参加第10步离心管 中剩余的溶液，重复第 11 步操作。13加500卩l C5溶液乙醇淋洗缓冲液至离心过滤管中，在室温下10000 >>离心30s,弃去管中液体。14在室温下

5、10000>g 离心 1min。15取出过滤柱小心放入新的2mL离心管中，防止任何 C5溶液溅到过滤柱上。16参加60卩I C豁液DNA洗脱液或无菌超纯水至过滤柱白色薄膜中，在 室温下 10000>g 离心 30s。17弃去离心柱，提取完成。分装-20 T保存，待下一步应用。实验二 可培养内生细菌的别离纯化保存1. 实验目的 1 别离东南景天内生菌，记录菌落数，菌落种类数，菌落形态，优势菌菌落 数。 2菌落纯化，保存菌种。2. 仪器和试剂内生菌别离1需要干热灭菌的仪器培养皿 150 个其中在 15 个培养皿中放入滤纸150mL 烧杯 75 个研砵 15 个 2 需要高温湿热灭菌的仪

6、器R2A培养基3000mL，分装至15个250mL三角瓶磷酸缓冲溶液150mL，至于200mL灭菌瓶试管+蒸馏水 2*3*5=30 支试管2000mL 蒸馏水，装入 1000mL 三角瓶1mL 枪头两盒其中 30 个需要剪缺口 锡箔纸 50 张 3 其他试剂99%酒精、 35%双氧水、 3%次氯酸钠内生菌纯化保存 1 需要干热灭菌的仪器培养皿 50 个2需要高温湿热灭菌的仪器50%甘油150mL约150个菌种用量，倒入200mL灭菌瓶。150 个冻存管，用保鲜袋包装。R2A固体培养基1000mL，分装至5个250mL三角瓶。R2A液体培养基1000mL，分装至50个50mL三角瓶。3. 实验步

7、骤3.1植物样品外表消毒灭菌烧杯：15个植物样5=75个制作 2000mL 无菌水。分别取4g植物样在自来水下冲洗 一一99%酒精1min一一 35%双氧水+3% 次氯酸钠 30min 无菌水冲洗三次。取g植物样用锡箔纸包装，做3个重复，液氮速冻，-80 C保存3.2可培养细菌的培养及纯化保存1细菌的培养基配方R2A培养基1000ml蒸馏水，酵母粉、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、葡萄糖、可溶性淀粉、KH2PO4、MgSO4 7H2O:、丙酮酸钠，配制R2A培养基3000mL，分装至15个250mL三角瓶，高温湿热灭菌121°C,20mi n。2磷酸缓冲溶液灭菌处理磷酸缓冲溶液：氯化钠；2P

8、O4; 2HPO4; 100ml蒸馏水；PH值。配制磷酸缓冲溶液150mL，至于200mL灭菌瓶，高温湿热灭菌121C ,20min。3研磨把消毒后的叶、茎和根，分别放在灭菌的研钵中，研磨成汁，参加3ml的磷酸缓冲溶液，搅拌均匀，静置10分钟，再搅拌。4稀释2*3*5=30支试管从研钵中取1ml的溶液分别稀释10倍、100倍5涂布分别从原液、10倍、100倍的溶液中取200微升到细菌的培养基上培养，每 个梯度做3个平行。用酒精浸泡，烧的时间长一些，叶、茎，考虑用不同的三 角刮刀15个植物样*3个浓度*3个重复=135个平板6平板培养一星期后，计数，并记录其菌落形态。同时，根据菌落特征。7菌种纯

9、化保存约50个菌种用量配制50%甘油150mL约150个菌种用量，倒入200mL灭菌瓶。准备150个冻存管，用保鲜袋包装。配制R2A固体培养基1000mL，分装至5个250mL三角瓶，配制R2A液体培养基 1000mL，分装至50个50mL三角瓶。以上仪器试剂使用高温湿热灭菌 121C ,20min。挑选不同的菌落到新的培 养基, 纯化 1次。挑单个菌落到R2A液体培养基中，30 C、160r/min，摇床12-16小时，摇到 对数期或对数末期，测OD值，取700 uL菌液并加300 uL 50%甘油于甘油管中，保存，每个菌保存 3 个甘油管实验三 CTAB 法提取植物内生菌 DNA1. 实验

10、目的利用 CTAB 法提取植物内生菌 DNA ，保存待测。2. 实验原理十六烷基三甲基溴化铵 (hexadecyltrimethylammo nium bromide, CTAB )是 一种阳离子去污剂， 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。 在高离子强度的溶液中 (>0.7mol/L NaCl)，CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合 物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质 后参加乙醇沉淀即可使核酸别离出来。3. 实验材料实验分 3 批完成1 液氮；2 研钵 6 个，干热灭菌；3 CTAB DNA 提取液：a. 100 mM Tris-HCl (p

11、H8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；b. 20 mM EDTA (pH8.0)螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNase 活性；c. 1.4 M NaCl提供一个高盐环境，使 DNA蛋白复合物DNP充分溶解；d. 2 % (w/v) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) 溶解细胞膜，并结合 核酸，使核酸便于别离；e. 1% PVP 40,000 (polyvinyl pyrrolidone) (聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的络合物， 能 与多酚形成一种不溶的络合物质， 有效去除多酚， 减少 DNA 中酚的污染； 同 时它也能和多糖结合，有效去除

12、多糖。将上述试剂混合后，灭菌 20 分钟，常温保存；4 酚氯仿异戊醇 按照酚:氯仿:异戊醇=48:48:4 的比例配置 蛋白质变性，同时 抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键 已断,蛋白分子外表又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚 相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点： 1.有效变性蛋白质； 2抑制了 DNase的降解作用。缺点： 1.能溶解 10-15%的水，从而溶解一局部 poly(A)RNA 。2.不能完全抑 制 RNase 的活性；5) 氯仿异戊醇 按照氯仿 :异戊醇=96:4 的比例配置。能克服酚的缺点； 加速有机 相与液相分层。最

13、后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚酚易溶于氯仿 中；6) 异丙醇 沉淀 DNA ；7) 70%的酒精 清洗 DNA ；8) 2 mL 与 1.5 mL 的离心管各 18 个，高温湿热灭菌。4. 实验步骤1收集大约100 mg的植物样品，在使用前保存于-80 C 。2 将样品放于研钵中，配合液氮，快速将样品磨成粉末状，将粉末尽量收集于 一个 2 mL 的离心管中。3将步骤2中的离心管中参加0.9 mL CTAB，漩涡震荡均匀，于65 C中水浴20-30 分钟。4 水浴后，参加 0.9 mL 氯仿异戊醇，上下翻转均匀， 12000 rpm 离心 8 分钟。5将离心后上清液510 yL转至另一干净

14、的1.5 mL离心管中，参加340 上清液体积的 2/3异丙醇，上下翻转均匀至有沉淀产生 ， 12000 rpm 离心 8 分钟。6离心后弃掉液体，用0.7 mL 70 %的酒精清洗，12000 rpm离心2分钟，小心 地弃掉废液，防止将 DNA 倒出。7 重复步骤 6。8 于通风橱中将酒精晾干，至透明状即可。9参加50卩灭菌水或TE水pH8.0 TE可延长DNA保存时间，将DNA于-20 C、-80 C长期保存。5. 考前须知：1) 实验前应先预热水浴锅。3. 2) 在对 DNA 质量要求不是特别高的情况下，用氯仿异戊醇即可，不用酚氯 仿异戊醇。实验四 植物重金属含量及土壤理化性质测定1. 实验目的 回校后保存植物样及土壤，待后续检测。2. 实验步骤 在获取根际土壤后，将取出的东南景天外表洗净，晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测量干重后，研磨，待测。植物重金属含量， 3 个重复，每个 重复，共需要植物根茎叶鲜重各 5g。内生菌别离试验后，取出土壤约lOOg,风干，研磨，过20目筛，保存 待测