组织RTPCR注意事项

1、1.抽提 RNA 都是为了得到其 mRNA ，而 mRNA 和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选 择用液氮保存组织。而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。2.提取 RNA 前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna 的降解。研磨要充分，使组织块变小。3. 加入 trizol 后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与 rna 分离。4. 其次是注意外源性的 rna 酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。操作速度要快，冰上进行。我做过大鼠下丘脑组织的 RT-PCR,在动物房将组织取好先放在RNa free 的 EP 管中，放在冰盒内，然后

2、再转移到实验室的 70冰箱内，在抽 RNA 的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看 到的，但是真的很好用，可以改善 RNA 抽提的质量。用生理盐水或 PBS 冲洗掉血液，分切成 50-100mg 大小的组织块，早点把提 RNA 的试剂盒买过来就可以根 据说明书加入变性液中（ep 管内），80 储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。如果试剂盒没到，那 就直接放在 EP 管中，提 RNA 的时候再拿出来再加也可以。就是组织可能会不容易撵碎一些。我觉得你可以用高压过的 EDPC 处理的水进行清洗（2 3 次），后迅速切成合适的大小的组织（具体大小 与 RNA 提取方法相关，我用的是

3、TRNZOL 法，一般取 50 100mg ,）于 EP 管中，直接放到80 度冰箱， 不需要液体浸泡！到时直接取出提取RNA 即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好DEPC 处理过！1. 组织块若没有很多血液，可直接冻存；2. 若有较多血液，可用生理盐水冲洗；3. 我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗；4. 一般 1cm 左右就可以，根据标本将来的用途。5. 直接原组织冻存。本实验室做过人子宫内膜 FGF 基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组织，冻存与 液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总RNA。因为我们的目的是 PCR 出目的基因，因此并不要求材料 1

4、00的纯净，只要引物正确，反应条件合适一般能克隆出目的基因。例如：从猪肝脏中提取总 RNA （本人实验经验） ：采用 Trizol 试剂从新鲜猪肝脏组织中提取总RNA。将液氮冻存的新鲜猪肝脏组织约50mg 放入 EP 管中，用研磨杵迅速研磨，然后加入 1mL Trizol 试剂室温裂解 5min。然后 10000r/min，离心 1min，将上清液转移 到另一新的EP 管中，加入 200 卩 L 氯仿轻轻混匀，室温静置 3min。4C，12000r/min，离心 10min，转移上 层水相至另一新的 EP管中，加入 0.5mL 异丙醇混匀，室温静置 5min。4C，12000r/min，离心

5、10min， 可以看到白色的 RNA 沉淀贴于 EP管底部，弃上清后用 75%的乙醇洗涤，真空干燥后用 100 卩 LDEPC 处理 过的 ddH2O 溶解 RNA 沉淀。含有 RNA 的溶解液立即反转录，剩余部分零下70C冻存。另外我用过 RNA 提取试剂盒效果也很好，方便，快速，纯度较高组织匀浆水处理枪头，电动匀浆器 DEPC 水处理的匀浆器，一次性换药包，一次性刀片， DEPC 器械：1.新鲜或冰冻组织用蒸馏水冲洗除去表面污物切下 1mm（3） 组织块2.将组织放入 1 。 5ml 的试管底，试管配有研棒3.加入 1mlTrizol4.插入研棒研磨碎组织块，旋转研棒将组织挤压在使馆壁上，

6、 10 次左右（电动 12 次）5.因标本已匀浆话，将匀浆管至于 4 度冰桶中 提取组织 RNA 提取 RNA提取组织 RNA 的准备事项1。准备 DEPC 泡的枪头，以及 DEPC 泡的匀浆器2。用 DEPC 配制的 1*PBS 清洗组织3。 准备 DEPC 水配制的 75%的酒精，泡制手术器械。带者酒精在火上燎一下。4。器械：离心管 2 支，吸管 4 个，酒精灯，打火机，记号笔，200ul,1000UL 枪，DEPC 泡过的枪头 EP 管，紫外照过的手套。滤纸，DEPC 纯水（750ml 无水乙醇+ 150mlDEPC 水,剧烈振荡，使劲的摇晃，直至混匀），氯仿，75 %酒精，异丙醇，Tr

7、izol，预冷的离心机（两种），EP 管架（洗液擦洗），手套，灭菌剪刀，镊子（2 个），冰桶，冰块，高灵敏度称量仪1.将组织取出后用眼科剪剪成 1mm3 左右的小块2.组织样品按 50 100mg/mlTrizol 加入 Trizol（组织体积不能超过 Trizol 体积的 10 %，否则匀浆效果不好， （此时可预冷另一个离心机） ，研磨 10 次左右（剩余的组织至于冰桶中，最后存于液氮中3.4 度， 12000g 离心去除不溶物 （ 匀浆得时候最好将匀浆器放置在冰水中以免发热 ）4.带双层手套，混合好的样品全部移置到0.1ml 的 EP 管中，室温 15 30 度静置 5 分钟5.加入 0.

8、2ml 氯仿/1mlTrizol,盖好 EP 管，剧烈振荡（上下颠倒），15 秒钟，室温静置 2 3min6.2 8 度，离心，10500rpm/min ，15min,取上清，用 200ul 在 20ul 刻度使用，小心不要使界面混淆， 剩余界面上不要）7.上清中加入等量的异丙醇 （一般是 0.5:1）, 颠倒 5 次（用 200ul 枪加小心），室温静置 10min7. 2-8 度离心， 10500rmp/min,10min, 弃上清8. RNA 洗涤： 75%酒精（这次用的 100%。未影响） 1ml 沉淀，轻轻弹其底部（直接放入 70 度冰箱可以 长期保存，静置几秒钟9 2 8 度离心，

9、 8500rpm/min,5min , 弃上清10.取出滤纸，将 EP 管敞开放在滤纸上，管口向酒精灯（不要完全干燥，不好溶解）11.DEPC 水溶解（30ul,可变），分装,2ul 电泳，2ul 比色，其余 5ul 分装至于手套中冻于20 度中 大概量为组织（ ugRNA/mg 组织）： 1 10ug28s 是 18s 亮度的两倍（晾干时间过长会使 RNA 降解）根据我抽提的经验，当提取组织 RNA 时一般都有白色沉淀，当细胞量多的时候也可以看到少许，不应该是 蛋白质。用酒精洗涤两次比洗一次好，然后等到差不多完全透明以后再加DEPC 水溶解，可以放四度冰箱过夜，然后比色。最好比色 1.82.

10、0，一般 1.70 以上都可以逆转录，没问题的。据我提取 RNA 的经验，一般在加入异丙醇并离心后都会在管底部看到一抹带状的白色沉淀，量不会很大， 如果很大的话，预后并不乐观，蛋白污染而且严重降解。如果提取材料量少的话，也有看不到任何东西的 情况，我就会弃之增大样本量， 因为肉眼看不到的话， 即使有也有限。 而且污染， 然后定量后才 DNA 以后， 跑胶看看提取的质量，有无降解，有无 RNA 我一般会在提取总 做 RT 的。所以我认为你应该适当增加提取的细胞数。1.TRIZOL :无论保存还是使用的时候都不要摇动，因为我们使用 TRIZOL 提取 RNA 实际利用的是异硫氰酸胍 /苯酚法，苯酚

11、很容易被氧化，所以不要摇动，使用时也要从最底层吸取，也就是避免破坏表面的保护层。2. 标本保存：提取组织 RNA 时涉及保存标本的问题，现在有一种样品储存液，其中含有RNase 抑制剂，可 以帮助保护 RNA，当然仍需低温.另外还可以将标本浸在 TRIZOL 里，一 70C或一 20C即可。3. 减少 DNA 污染：可以适当多加一些 TRIZOL4. 晾干：75 %酒精洗涤 RNA 沉淀后，需要晾干。建议 75 %酒精洗后再用无水乙醇冲洗一边，这样液体挥 发的比较快2.4.晾干：75 %酒精洗涤 RNA 沉淀后，需要晾干。建议 75 %酒精洗后再用无水乙醇冲洗一边，这样液体 挥发的比较快我认为

12、第四步有点问题，原理和操作都有问题！ 通常我这么来晾干，1、尽量吸干 75%的乙醇；2 、 5000rpm 短暂离心；3、再次用黄色 tip 头吸干，尽量吸干液体4、自然风干 5 min，绝对可以做以后的实验了！3.其实 Trizol 的工作容量是有一定限度的， 当蛋白质特别丰富的时候，有的时候蛋白质不能全部沉在中间层， 可以把上清提出来，用 Trizol 重新提取，（充分振荡，加氯仿） 把蛋白质逐步去处。也可用酚氯仿反复抽提。 需要特别指出的是，本人更推荐单独用酚充分振荡，然后再加氯仿， 不提倡酚氯仿提前混在一起。我刚做过肝肺的。结果很不错。 （斑竹给我加分鼓励我啊）一、组织抽提：1. 取组

13、织块 60mg左右，加入 400 - 600ul 的 TRIZOL 用匀浆器撵成浆液状。2. 然后移到 1.5ml 的 EP 管中，加入剩余的 Trizol，最终 Trizol 的量为 1ml。3. 冰上孵育 5 分钟5.离心 12,000g 4C5 分钟 取上清液移入 1.5ml 新离心管。注意取组织块不要太多。太多反而效果不好。我们这么做出来的0D 值都在 1.9 左右。后面的步骤就和做细胞的 RT-PCR 一样了。在反应体系中加入 BSA （10 - 100ug/ml ）可屏蔽有害物质对 PCR 的抑制作用，提高扩增成功率。 我们的方法如下：1、 取材时，最好预先准备好去 RNA 酶的水

14、或生理盐水，组织取下后，用 RNA 酶的水或生理盐水冲洗干净；2、器材最好 200 度干烤 2 小时，塑料制品用 0.1 % DEPC 水浸泡过夜，烤干后高压；度冰箱。 -80、我们一般放在液氮里，如果不方便的话，可以从液氮里转到31 各种器械一定要高温（ 180 度 4 小时或 200， 2 小时）烤，取材用的玻璃器皿，锡箔纸，最好都烤过。 2 塑料制品泡 DEPC，高压后（去除残留的 DEPC），烤干。3，操作时动作迅速，戴帽子口罩手套该是常识吧。4 尽量用新鲜组织。非要保存当然要液氮，保存时间不宜过长。我们实验室用的只是普通高压过的器械，也没有什么问题。不放心的话，可以用DEPC 泡一下

15、再高压，至于 TIP 头还是泡一下，安全起见，但我同学提的时候从不用 DEPC 也照样能提出来啊，他们说新的包装里面一般没有污染的，但装入盒时一定要带口罩阿 如何去除 RNA 酶外源性来源1.被污染的缓冲液 2. 自动移液装置应采取的措施1.当处理 RNA 酶时保证自动移液器专用2.将要用到的用于 RNA 试验的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液留出来专用3.分成小份保存溶液或缓冲液并在用后丢弃。不用已经在试验室用于其他目的的材料或储存液4.留出专门用于分离 RNA 的电泳装置。用清洁剂清洗后再用流水冲洗， 乙醇清洗干燥后加入 3的 H2O2。 室温 10分钟后用 DEPC 处理过的水彻底冲洗电泳槽5

16、.准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA 酶的玻璃器皿、DEPC 处理过的水，用于 RNA 的化学用品用一次性刮刀或直接敲击瓶底分离。可能的化，用0.1 %的 DEPC 在 37C处理溶液至少 1 小时后在 15pis( 1 . 05kg/cm2 )高压蒸汽灭菌 15 分钟6.灭菌的玻璃器皿和塑料制品不能有效灭活RNA 酶。300 C 烘烤玻璃器皿 4 小时。用 DEPC 活其他灭活基于接触的 RNA 酶的商业化产品处理塑料制品7.用声誉好的厂家证明无 RNA 酶的一次性移液器头和微量离心管。为了减少污染的机会，当从原包装去 除这些小的器皿放在实验室架上时最好用无菌的镊子8.在分离 RNA 的

17、过程中用抑制剂以抑制 RNA 酶的活性1 注意无酶操作，包括戴手套，口罩，EP 管最好用 DEPC 水泡后高压。2 操作迅速，留取标本后尽快液氮冷冻保存或冻后放入 -70 度冰箱保存。 使用专门处理过的冷冻管，进口的为佳。手套一定要戴，器械高温(300)消毒，标本液氮保存。组织液氮冻存后短时间内提取 RNA，再将 RNA -70 度保存，可行吗？ RNA 在-70 度能保存多久？另一个问题，组织在-70 度能保存多久？有个博士说她的组织在-70 度保存一段时间后抽不出 RNA 了，建议一直保存在液氮内。RNA 要想保存的时间长，最好保存在甲酰胺里面，用的时候再纯化了使用。或者提取的时候到用75

18、%乙醇洗涤时停止，将 RNA 沉淀保存在 75 %乙醇(DEPC 水配置)里面，放在20 度冰箱，一年应该没有问题。要用新鲜的组织 ,至少也是用液氮处理后保存于 -70 度冰箱的组织 .对于刚进实验室的研究生可能一片茫然，为了节省大家的时间，向大家介绍一下 RT PCR 所需 的实验耗材及试剂。 首先，必须设计目的基因引物和内参照引物(或试剂盒自带)此时，你需下列产品：浓度配制 1.DEPC 用纯水按 0.1% 2.Tip 10ul 200ul 1ml)3.EP Tube (1.5ml ) 4.Tip Box (10ul 200ul 1ml ) 5.EP Box (1.5ml )200ul 或

19、 500ul6.PCR Tube(7.PE 手套 将耗材及器皿等放入 DEPC 水中浸泡过夜，第二天高温高压灭菌，烘干，待用。于低温保存。最好 RNA 试剂盒先做抽提 RNA 的预实验，也可将抽提样品的购买 Total RNA 现提现用。引物合成好后，就可以做 RT-PCR 啦。可以大大降低。(对于新手)PCR的反应条件相对不好掌握， 推荐二步法 RT-PCR试剂盒由于试剂盒成 本。 1.Agarose 2.EB电泳，需要下列试剂：RT-PCR 产物出来后，接下来的工作就是 Agarose 3.DNAMarker4.Tris.base5.EDTA以上所述可根据个人具体情况作相应的调整。希望能给广大战友带来方便。,不就再买只大鼠嘛最好是新鲜的不用加液提取试剂,（取出脑组织后放到研钵里，加 RNA 另外，脑提 RNA 和用细胞提差不