乙型肝炎疫苗加强免疫诱导小鼠细胞免疫应答相关因素的研究.

1、乙型肝炎疫苗加强免疫诱导小鼠细胞免疫应答相关因素的研究关键词：乙型肝炎疫苗 ; 细胞免疫 ;酶联免疫斑点实验摘要：目的探讨现有乙型肝炎(乙肝)疫苗(hepatitis b vaccine, hepb)在小鼠(h-2d)加强免疫中，不同免疫剂量、免疫时间及检测时间对细胞免疫检测的 影响。方法 采用三种疫苗剂量，两种加强免疫程序免疫 balb/c 小鼠，即初次 免疫后 14d 加强免疫和初次免疫后 28d 加强免疫，分别于加强免疫后 7d、 14d 分离小鼠脾单个核细胞(mononuclear cell，mnc)，使用酶联免疫斑点实验(en zyme-li nked immuno spot ass

2、ay.elispot)测定小鼠 mnc 的干扰素(interferon, ifn)- 丫、白细胞介素(interleukin, il)-2 和 il-5 斑点形成细胞数(spots-forming cell,sfc) 。结果 加强免疫后 7d, ifn- 丫和 il-2 的分 泌均处于较高水平，而加强免疫后 14d 检测时两者 sfc 均出现下降；同时 14d 时 可见 elispot 阳转率也下降，而加强免疫后 7d 时阳转率均为 100%;14d 加强免 疫与 28d 加强免疫程序相比，前者在加强免疫后7d、14d il-2 分泌水平均高于后者，在 28d 加强免疫后 7d 检测 il-5

3、 阳转率均较高，14d 时其阳转率出现下 降。结论hepb 在第 14d 进行加强免疫能够诱导较高的细胞免疫反应，加强免疫后 7d 可检测到较高的细胞免疫反应。乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatitis b virus ，hbv)感染现在仍是全球性的健 康问题，全球每年约有 100 万人死于与 hbv 感染相关的肝病 1-2 。我国是乙肝 高流行地区之一，乙肝疫苗(hepatits bvaccine，hepb)的应用在控制乙肝流行中起了重要作用。现有的铝佐剂 hepb 能够诱导产生体液免疫反应，高水平的抗 体能够保护机体抵抗 hbv 的急性感染3。而近年来的研究发现，hepb 诱导的 细胞免疫在

4、母婴阻断 4 、慢性乙肝治疗 5 中可能起着重要作用。通过对 hepb 加强免疫程序及细胞免疫检测时间的探索，对全面评价hepb 的免疫作用具有一定的意义，同时本研究结果能够为新型 hepb 评价研究提供一些参考数据。材料与方法1hepb 重组 hepb(汉逊酵母)(hepb medebyrecombinantdeaxyribonucleic acidtechnigues in hansenula polymorphayeast ， hepb-hpy) ，由辽宁省大连汉信生物制药有限公司提供， 规 格为 10 卩 g(微克)/0.5m(l 毫升”支。 2 实验动物 68 周龄 balb/c雌鼠

5、， 购自中国食品药品检定研究院动物中心。3 实验程序 hepb-hpy 稀释至 10 卩 g/ml、5 卩 g/ml、2.5 卩 g/ml，采用背 部皮下注射进行免疫，每只小鼠剂量为 100 卩 l。初次免疫后第 14d 使用相同剂 量进行加强免疫一次，之后分别于加强免疫后第 7d 和第 14d 进行酶联免疫斑点实验(enzyme-linked inmunospot assay, elispot);另一组在初次免疫后 28d加强免疫一剂，也于加强免疫后第 7d 和第 14d 进行实验。4 elispot 实验 免疫后的 balb/c 小鼠在到期之日颈部脱臼处死，无菌 取脾，经400 目筛网研磨

6、得到脾细胞悬液；使用 nycoprep?淋巴细胞分离液(挪 威 axis-shield公司)分离得到脾单个核细胞(mononuclear cell，mnc),使用1640 培养基洗涤两次后， 重悬于完全培养基中。 经不同免疫程序后收集的小鼠 脾 mnc调至 4X106/ml 后， 每孔 100 卩 l 加入板中， 每孔加入 100 卩 l 乙肝病毒 表面抗原 (hbvsurfaceantigen , hbsag)s28-39 肽(序列为： ipqsldswwtsl ,终 浓度为 10 卩 g/ml)或80 卩 g/ml hbsag 作为刺激物，其中干扰素(interferon,ifn)- 丫检

7、测使用肽刺激，白细胞介素(interleukin , il)-2 和 il-5 检测使用 hbsag 刺激，并设阴性和阳性对照孔，之后37C5%co2 培养 20h(ifn- 丫和 il-2)或 40h(il-5)。按照 elispot 试剂盒(美国 bd biosciences 公司)说明进行洗板 显色。使用 immunospottm 系统(美国 cellular technology公司)对斑点形成细胞数 (spots-forming cell ， sfc) 进行计数。结果1 初次免疫后第 14d 加强免疫三种不同剂量的 hepb 在初次免疫后第 14d 进行加强免疫，之后 7d、14d

8、采用 elispot 检测 ifn- 丫 il-2 的 sfc(图 1)。7d 时 ifn- 丫、il-2的阳转率均达 100%但分泌细胞因子的 sfc 与剂量反应规律 不一。随着疫苗剂量的下降，ifn- 丫、sfc 值降低;il-2的反应则在三个剂量时均处于较高水平。加强免疫后第 14d 检测时发现，ifn- 丫的反应较 7d 时出现 明显下降， il-2 的分泌在较低的两个浓度中出现下降，高剂量疫苗组仍维持在 较高水平(图1)。由表 1 可见，il-2 在三个剂量组中加强免疫后 7d 和 14d 阳转 率均为 100% ifn- 丫在 14d 时阳转率较 7d 时为低，最低为 20%2初次

9、免疫后第 28d 加强免疫在初次免疫后第 28d 加强免疫，之后分别在第 7d 和第 14d 通过 elispot 检 测细胞因子分泌水平。图 2 显示：ifn- 丫的反应在第 7d 时剂量效应关系不明 显，而在第14d 检测时可见两个低剂量组均出现 sfc 下降;il-2的反应在第 7d时以 1 卩 g 剂量组最高，在第 14d 时各剂量组结果相近，无剂量效应关系。从表 2 中elispot 阳转率可见，加强免疫后 7d 各剂量组均达到 100%日转，加强免疫 后 14d 检测时 ifn- 丫 elispot 阳转率降低至 80%略低于 7d 时结果。在加强免疫后两个时间点用 elispot

10、 检测 il-5 的分泌水平，由图 3 可见， 加强免疫后 7d 随着疫苗剂量的下降， il-5 阳转率逐渐下降 ; 而加强免疫后 14d 的结果表明，较高剂量组的 il-5 阳转率均较 7d 时出现下降，仅低剂量组阳转 率仍保持在 60%。3不同加强免疫时间及检测时间细胞免疫反应的差异在两种加强免疫时间 条件下均可见，加强免疫后 7d 检测的 ifn- 丫和 il-2 细胞因子 sfc 值高于 14d 时检测结果，说明在加强免疫后机体内记忆性免疫反应随着时间的推移会逐渐 下降。对于两种细胞因子，在加强免疫后 7d 检测结果进行比较可见，初次免疫 后第 14d 加强免疫，其 sfc值高于 28

11、d 加强免疫后结果 ; 而通过 il-5 sfc 的阳 转率亦可见，加强免疫后 7d 的反应高于加强免疫后 14d 的反应。讨论作为预防性疫苗使用的铝佐剂重组 hepb 在控制乙肝的流行及发病中起了关 键性作用。但慢性 hbv 感染尚无有效的方式完全清除患者体内的病毒，现在进 入临床研究的多种治疗性疫苗，如免疫复合物疫苗 6-7 、多肽表位疫苗 8-9 和核酸类疫苗，在慢性乙肝的治疗中提供了多种参考思路，如何诱导慢性乙肝 患者细胞免疫的产生，是这些治疗性疫苗的研究重点。而对现有的预防性疫苗 及新型佐剂疫苗的评价，除了在传统的抗体水平外，其诱导的细胞免疫亦引起 人们的关注。由于至今尚无 hbv

12、感染的动物模型，临床前的免疫效果评价大多 基于小鼠实验。胡忠玉等曾对单剂 hepb 的剂量效应做了一些研究 12 ，而治疗性 hepb 在 临床应用中多使用较多剂次的免疫。但发表的新型 hepb 论文中，关于免疫剂 量、时间等因素的影响报道较少，而在免疫应答中抗原的特性、抗原的剂量、抗原进入的途径、免疫时间及检测时间、检测因子类型等因素对免疫应答的结 果都有重要的影响。而特异性 t、b 细胞增殖需要反复接触抗原，免疫应答后期 由于抗原量的下降， il-2 及其受体的表达也减少，导致抗原特异性 t 细胞发生 凋亡，因此大部分抗原特异性细胞随免疫应答的结束而凋亡，只有一小部分 t 、b 细胞保留下

13、来成为长期存活的抗原特异性记忆细胞。本研究中二种不同剂量的疫苗，单只小鼠免疫剂量最咼为1.0 卩 g,最低为0.25 卩 g,在第 14d 相同剂量加强免疫一剂后 7d 和 14d, elispot 检测 ifn- 丫 和 il-2均发现，结果高于第 28d 进行加强免疫的各组。可见初次免疫后加强免 疫的时间延长造成免疫应答反应的下降。本结果有助于在疫苗多剂次免疫评价 时提供免疫时间方面的参考 ; 在免疫检测时间比较中,两种加强免疫程序、两种 细胞因子均可见 7d 时细胞因子分泌高于 14d 时，可见随着免疫时间的增加，机 体内记忆性 t 细胞减少 ; 而加强免疫之后早期可获得较好的细胞免疫反

14、应。在两 种加强免疫程序后 7d 进行 elispot 检测时，三个剂量的疫苗 elispot 阳转率均 达到 100%，可见低剂量的疫苗经加强免疫后也可诱导较好的细胞免疫反应。施 理等亦发现，hepb 剂量与其诱导的细胞毒性 t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte，ctl)水平及细胞因子分泌相关10-11。治疗性 hepb评价中一般 采用多剂次加强免疫，我们的研究表明，在小鼠中多剂次免疫较少剂量的抗原 即可使细胞免疫反应达 100%，且细胞因子水平随种类不同规律亦不同。这提示在较高剂量时可能出现免疫抑制现象，不利于正确评价疫苗的免疫效果。同时 对加强免疫后 il-5 检测的结果提示，辅助性 t 细胞(helper t lymphocyte ， th)2 类细胞因子的分泌规律与 th1