细胞的分离和破碎ppt课件

1、 第第 二二 章章 细胞分别与破碎细胞分别与破碎 Cell isolation and disruption一、预处置的目的一、预处置的目的 1 改动发酵液的物理性质，提高固液分别效率改动发酵液的物理性质，提高固液分别效率 加热加热 调调pH 絮凝和凝聚絮凝和凝聚 2 尽能够使产物转入便于后处置的某一相中尽能够使产物转入便于后处置的某一相中 例如例如:四环素类抗生素的消费四环素类抗生素的消费 2.1 发酵液的预处置发酵液的预处置 3 去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作 杂质中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等杂质中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等

2、 二、预处置的详细方法 1. 高价无机离子的去除方法 去除钙离子：通常运用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适宜用量较大的场所。 去除镁离子：参与三聚磷酸钠，与镁离子构成络去除镁离子：参与三聚磷酸钠，与镁离子构成络合物。合物。用磷酸盐处置，也能大大降低钙离子和镁离子的用磷酸盐处置，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。浓度。例如：环丝氨酸的提取。去除铁离子去除铁离子: 参与黄血盐，使其构成普鲁士蓝沉参与黄血盐，使其构成普鲁士蓝沉淀而除去。淀而除去。 2 杂蛋白质的除去杂蛋白质的除去 (1) 沉淀法沉淀法 盐析盐析 调理调理pHpI (2) 吸附法吸附法 参与吸附剂或沉淀剂参与吸附

3、剂或沉淀剂 (3) 变性法变性法 加热，大幅度调理加热，大幅度调理pH，加有机，加有机溶剂或外表活性剂等。溶剂或外表活性剂等。(4) 凝聚凝聚Coagulation和絮凝和絮凝flocculation 目前工业上最常用的预处置方法之一。目前工业上最常用的预处置方法之一。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处置。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处置。 向胶体悬浮液中参与电解质，由于双电层电位降低，向胶体悬浮液中参与电解质，由于双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集集1mm左右的景象。左右的景象。 常用的凝聚剂有：常用的凝

4、聚剂有：Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCO3 凝聚凝聚胶体双电层的构造 絮凝絮凝 指在某些高指在某些高分子絮凝剂分子絮凝剂存在下，在存在下，在悬浮粒子之悬浮粒子之间发生架桥间发生架桥作用而使胶作用而使胶粒构成粗大粒构成粗大10mm的絮凝团的的絮凝团的过程。过程。 根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。 根据其来源的不同，工业上运用的絮凝剂又可分为如下三类： (1)有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物。 (2)无机高分子聚合物。 (3)天然有机高分子絮凝剂。絮凝剂的分类絮凝剂的分类 絮凝效果与絮凝剂的

5、分子量和类型、絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、加量，溶液的加量，溶液的pH，搅拌速度和时间等，搅拌速度和时间等要素有关。要素有关。带负电荷的菌体带负电荷的菌体 或蛋白质或蛋白质阳离子型高分子絮凝阳离子型高分子絮凝剂剂电解质电解质 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂+包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。3. 有色物质的去除及其他有色物质的去除及其他 1运用吸附剂去除有色物质运用吸附剂去除有色物质 离子交换剂、离子交换纤维、离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等活性炭等 2用工业酶制剂可净化发酵产用工业酶制剂可净化发酵产物，除去干扰性浑浊物物，除去干扰性浑浊物 淀粉酶：

6、不溶性多糖淀粉酶：不溶性多糖 单单糖糖 3) 运用惰性助滤剂 硅藻土、纸浆、珍珠岩等 4参与反响剂 环丝氨酸发酵液用CaO和H3PO4处置一、一、 发酵液的过滤特性和滤饼的分量比阻发酵液的过滤特性和滤饼的分量比阻rB 发酵液：高粘度，非牛顿流体，发酵液：高粘度，非牛顿流体， 滤饼可紧缩。滤饼可紧缩。2.2 固固 液液 分分 离离 滤饼滤饼传统的过滤cakeConventional filtration滤饼的分量比阻滤饼的分量比阻rB：表示单位滤：表示单位滤饼厚度的阻力系数，是衡量过滤特饼厚度的阻力系数，是衡量过滤特性的主要目的。性的主要目的。 对于不可紧缩滤饼，比阻值为常对于不可紧缩滤饼，比阻

7、值为常数，数， 但对于可紧缩滤饼，但对于可紧缩滤饼，rB=fp。如忽略过滤介质的阻力，恒压下的过滤速率方程式为：如忽略过滤介质的阻力，恒压下的过滤速率方程式为：q 到瞬间到瞬间，经过单位过滤面积的滤液量，经过单位过滤面积的滤液量，m3/m2；p 操作压差，操作压差，Pa； 过滤时间，过滤时间，s； 滤液黏度，滤液黏度，Pa.s;rB 滤饼的分量比阻滤饼的分量比阻,m/kg;XB 经过单位体积滤液所构成的滤饼干重经过单位体积滤液所构成的滤饼干重,kg/m3;22BBpqr X 在不同时间在不同时间测定滤液量测定滤液量,根据过滤面积就可得根据过滤面积就可得q 值。以值。以q为横轴，为横轴， /q为

8、纵轴作图，所得直线获为纵轴作图，所得直线获得斜率得斜率M。 2BBr XqMqqp2BBM prX二、影响过滤速度的要素二、影响过滤速度的要素 菌种菌种 真菌易过滤；放线菌过真菌易过滤；放线菌过滤较困难，需预处置；细菌滤较困难，需预处置；细菌过滤非常困难，絮凝预处置。过滤非常困难，絮凝预处置。培育基组成培育基组成 发酵终止时间发酵终止时间 三、固三、固-液分别设备液分别设备板框式压滤机板框式压滤机 国内广泛采用国内广泛采用优点：构造简单、价钱低廉、过滤面优点：构造简单、价钱低廉、过滤面积大。积大。缺陷：不能延续操作、劳动强度大、缺陷：不能延续操作、劳动强度大、滤液廓清度不高。滤液廓清度不高。f

9、ilterfilterfilterfiltratesolids recovery upon backflushFigure2.1 Schematic respresentation od s filter pressConceptual representation of plate and frame filter2. 鼓式真空过滤机鼓式真空过滤机 主要用于霉菌发酵液的过滤主要用于霉菌发酵液的过滤优点：优点： 能延续操作，实现自动化控制，能延续操作，实现自动化控制，适用于处适用于处 理量大而固体含量较多理量大而固体含量较多的滤浆。的滤浆。 缺陷：压差较小，不适用于滤饼阻力缺陷：压差较小，不适

10、用于滤饼阻力较大的物料。较大的物料。 DryWashImmersionKnifeCakeFeedRotary vacuum filter真空旋转过滤机 3. 错流过滤错流过滤 是一种新的过滤方式，与常规过滤的区别在于它是一种新的过滤方式，与常规过滤的区别在于它的固体悬浮液流动方向与过滤介质平行的固体悬浮液流动方向与过滤介质平行 。 优点：过滤速度快优点：过滤速度快 缺陷：固液相的分别不太完全缺陷：固液相的分别不太完全错流过滤方式错流过滤方式进料液进料液滤出液滤出液回流液回流液4. 离心分别设备离心分别设备 A 离心分别法离心分别法 1差速离心差速离心 生化工业最常用的方法生化工业最常用的方法

11、2区带离心区带离心 生化研讨生化研讨 分为差速区带离心和平衡区带离心分为差速区带离心和平衡区带离心 用于核酸、蛋白质的分别纯化用于核酸、蛋白质的分别纯化B 离心分别设备离心分别设备1管式离心机管式离心机2碟片式离心机碟片式离心机3三相倾斜式离心机三相倾斜式离心机 含固量较多的发酵液含固量较多的发酵液 细胞破碎细胞破碎:选用物理、化学或机械的方法选用物理、化学或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。来破坏细胞壁或细胞膜。 2.3 细细 胞胞 破破 碎碎2.3.1 细胞膜、细胞壁壁的构造和化学组成细胞膜、细胞壁壁的构造和化学组成 1. 细菌细菌 2. 真菌和酵母真菌和酵母 由难到易的大致陈列顺序为：植物

12、细胞由难到易的大致陈列顺序为：植物细胞真菌如酵母菌革兰氏阳性菌革兰氏阴真菌如酵母菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌动物细胞。性菌动物细胞。细胞膜的构造细胞膜的构造革兰氏阳性菌细胞壁的构造革兰氏阳性菌细胞壁的构造 革兰氏阴性菌细胞壁的构造革兰氏阴性菌细胞壁的构造 2.3.2 细胞的破碎机理细胞的破碎机理 P242.3.3 细胞的破碎细胞的破碎 一、细胞破碎技术的分类一、细胞破碎技术的分类 高 压 匀 浆珠 磨 破 碎撞 击 破 碎超 声 破 碎机 械 破 碎 法化 学 试 剂 处 理酶 溶化 学 破 碎 法渗 透 压 冲 击 法冻 结 融 化 法物 理 破 碎 法细 胞 破 碎 法 二、细胞破碎方法二、

13、细胞破碎方法 1. 机械破碎机械破碎 1) 高压匀浆法高压匀浆法 baNkpS11ln其中：其中：S S为细胞破碎率；为细胞破碎率；p p为操作压力；为操作压力；N N为循环操作次数；为循环操作次数； k k为破碎速率常数，与细胞种类和操作温度有关。为破碎速率常数，与细胞种类和操作温度有关。特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会升高，需于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会升高，需对料液作冷却处置，维护目的产物活性。对料液作冷却处置，维护目的产物活性。 影响要素：主要有压力、循环操作次数和温度。影响要素

14、：主要有压力、循环操作次数和温度。 2) 珠磨 ktS11ln其中：其中：S S为细胞破碎率；为细胞破碎率；t t为间歇操作破碎时间；为间歇操作破碎时间；k k为破碎速率常数为破碎速率常数破碎动力学破碎动力学QVt 其中：其中：t t为延续操作破碎时间；为延续操作破碎时间； V V为悬浮液体积为悬浮液体积,m3; ,m3; Q Q为料液流量为料液流量, m3 /s, m3 /s影响要素影响要素: : 破碎效果取决于振动速度、破碎效果取决于振动速度、接触时间、助磨剂大小、用量及菌体浓接触时间、助磨剂大小、用量及菌体浓度等。度等。用于有大量菌丝体和一些有亚细胞器用于有大量菌丝体和一些有亚细胞器的微

15、生物细胞的破碎。的微生物细胞的破碎。两种方法的比较两种方法的比较高压匀浆法高压匀浆法珠磨法珠磨法操作参数少，易于确定操作参数少，易于确定 操作参数多，一般凭经验估计操作参数多，一般凭经验估计24次循环次循环 一次操作一次操作级间冷却级间冷却 破碎和冷却双重功能破碎和冷却双重功能应用范围较窄应用范围较窄应用范围广，绝大多数微生物应用范围广，绝大多数微生物3撞击破碎撞击破碎 4 4超声波破碎超声波破碎破碎机理破碎机理: : 利用发射利用发射5 5z z的超声波的超声波探头处置细胞悬浮液。探头处置细胞悬浮液。可选配变幅杆 可选配变幅杆：2、3，10，15，18 破碎容量：0.5-600ml 占空比:

16、0.1-99.9% 2. 非机械法非机械法 1酶溶法酶溶法 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。方法。 外加酶法外加酶法 微生物细胞：溶菌酶、几丁质酶真微生物细胞：溶菌酶、几丁质酶真菌菌 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶果胶酶 自溶法一种特殊的酶溶方式自溶法一种特殊的酶溶方式 微生物产生的溶胞酶水解本身细胞壁上的聚合微生物产生的溶胞酶水解本身细胞壁上的聚合物构造，使菌体自溶。物构造，使菌体自溶。 用于消费最典型的例子是酵用于消费最典型的例子是酵母自溶物的制备。母自溶物的制备。 2化学法化学法 用化学试剂改动细胞壁或膜的

17、通透性，使内含物用化学试剂改动细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性地浸显显露来。有选择性地浸显显露来。 酸碱处置酸碱处置 化学浸透法化学浸透法 a. 外表活性剂外表活性剂 主要是破坏内膜的磷脂双分子层，释放胞内物质主要是破坏内膜的磷脂双分子层，释放胞内物质 b. EDTA螯合剂螯合剂 处置革兰氏阴性菌，对细胞外层膜有破坏作用处置革兰氏阴性菌，对细胞外层膜有破坏作用c. 有机溶剂有机溶剂 甲苯溶解细胞壁中的类脂甲苯溶解细胞壁中的类脂d. 变性剂变性剂 盐酸胍盐酸胍3 物理法物理法 浸透压冲击法浸透压冲击法 特点：适用于易于破碎的细胞，如特点：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌；对革兰

18、氏阳动物细胞和革兰氏阴性菌；对革兰氏阳性菌不适用。性菌不适用。 冻融法冻融法特点：此法主要适用于大肠杆菌和特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放。间质的酶的释放。 3. 机械破碎法与非机械法的比较机械破碎法与非机械法的比较比较项目比较项目机械法机械法非机械法非机械法破碎机理破碎机理切碎细胞切碎细胞溶解局部壁膜溶解局部壁膜碎片大小碎片大小细小细小较大较大内含物释放内含物释放全部全部部分部分黏度黏度高（核酸多）高（核酸多）低（核酸少）低（核酸少）时间，效率时间，效率时间短，效率高时间短，效率高时间长，效率低时间长，效率低设备设备需专用设备需专用设备不需专用设备不需专用设备通用性通用性强强差差经济经济成本低成本低成本高成本高应用范围应用范围实验室，工业实验室，工业实验室实验室三、破碎率的测定三、破碎率的测定 1. 直接测定法直接测定法 破碎前用显微镜或电子微粒计