8Chapter26白细胞分化抗原和黏附分子的检测(精)

1、目的要求m掌握：白细胞分化抗原、细胞表面黏附分子及可 溶性黏附分子的测定方法和原理；田熟悉：黏附分子基因及其表达的测定方法;4了解：白细胞分化抗原、黏附分子测定的临床应 用。白细胞分化抗原和黏附子的检测第一节白细胞分化抗原测定右 白细胞分化抗原 leukocyte differentiation antigen, LDA免疫细胞的膜分子免疫细胞在分化.成熟以及活化过程中，膜分 子的表达会发生一系列的变化，如出现或消失. 上调或下调。绝大多数是跨膜的（糖）蛋白右分化群 cluster of differentiation、CD应用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法， 将来 自不同实验室的单克隆抗体

2、所识别的同一分化抗原归为一个分化群，并以此代替分化抗原以往的命名。1生物学意义可作为表面标志用于细胞的鉴定和分离;以受体-配体的作用方式广泛参与细胞生长. 成熟.分化.发育.迁移、激活；异常表达与某些临床疾病的发生和发展有关。T cell development is marked by cell surfacemolecule cha ngesAs T cells mature in the thymus they changetheir expression of TcR-associated molecules and coeceptors.These changes can be us

3、ed as markers of their stage of maturationFSIrL /Lrgedouble7OSf0,kJGD3/TcR CD4-veCDS-V&aioubfGposSvc yftCD25 or CD25 +CCM4+ YSTcR+ve orCD44IOIV003+vcCD4-veCD8-veCD3+veTcRp-chain +vesurrogate TcRachain +ve (pTa)CD4+veCDB+ve98%3T83+veTcRap+veCD4+verSn.ate =postwC03+vcT cRa +veC08+veho 7.5 TM role

4、ef CD4 and CM() Schematic ncprrwntanon of the intcruction between TCR and anciKcnk pepekie pmented tn clau. II MHC mokculs：D4旺bil际ihn configuration by binding the cZ I! MHC nkculc. (b) CDK hat a f&milAr roU. but in the interaction withantigen prexnted bv a class I MHC molecule.初始 T 细胞CD28CD4MHC

5、II类分子CD28 与 B7 结合产生初始 T 细胞激活的协同剌激信号.同时诱导 CTLA-4(CD152)的表达。APC活化 T 细胞CTLA-4 与 B7 的结合力强于 CD28,并向活化 T 细胞传递抑制佶号CD28与CTLA-4的作用示意图B细胞伫号Th细胞抗原加工、提呈BCRTh活化信号TCR-CD3复合物ICAM-1伯号 信号 CD20 T 细胞系表达 CD2、CD3、CD5、CD7阵发性睡眠性血红蛋白尿症：CD55、CD59 表达降低 CD55、CD59 是重要的补体调节蛋白，通过 结合 C8.C9 阻止补体攻击复合物的形成而 抑制细胞溶解。白其 FCM 通过单抗荧光免疫标记（血

6、小板膜糖蛋白 Ilb/UIa, CD62、CD63）监测塞性疾病的诊断和治疗。艾滋病的诊断和治疗 CD,分子是人类HIV的主要受体 HIV选择性破坏CD4+细胞（Th细胞）艾滋病患者：CD,细胞/1 , CD4+/CD8+比值降低甚至倒 置，出现症状时CD4+细胞300个/M1, CD,细胞200个/卩1时，则为疾病恶化的先兆。治疗过程中，CD4*细胞绝对计数是评估疗法的重要指标。血栓与出血性疾病的诊断和治疗Ill血小to占疾病发病机制的研究 TNFRSF中有多个成员的胞浆区含有死亡结构域,当该受体与相应的配体结合后通过胞浆区死亡 结构域转导凋亡信号，引起细胞死亡。 Fas (CD95) /F

7、asL (CD95L)是某些器官特异 性自身免疫反应的一种共同致病机制Nature Reviews | Cancer IDDM：正常胰腺细胞不表达Fas,胰腺局 部APC和CTL相互作用产生的IL-l P和NO可选择性诱导P细胞表达Fas,非P细胞抗 原特异的多克隆自身CTL活化后表达FasL。桥本甲状腺炎：正常甲状腺细胞表达FasL,但不表达Fas。自身免疫应答产生I L-l P诱达，引起甲状腺细胞死亡。导同时上调FasL的表第二节黏附分子的测定黏附分子：是介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接 触和结合的分子，多位跨膜糖蛋白。粘附分子以受体-配体结合的形式发挥作用，参与细胞 的识别、活化和信

8、号转导、增殖和分化、伸展与移动。常以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。大部分黏附分子也属于CD分子白细胞的活化(PAFM活LFA-1)活化内皮细胞释放PAF白细胞的回定(LFA-1审固结合ICAM-1)哩液酸化的C015S) )LFA-1ICAM-1PAF受体送血管内皮细鮑白细胞的游出白细胞与内皮细胞粘附及渗出示意图淋巴细胞归巢“酶免疫组织化学方法“荧光免疫组织化学方法“酶免疫测定法淋巴细胞表面的L选择素与Glycam -1-CD34结合开 始在高内皮静歸表 面滚动；趋化因子与淋巴细 胞表面的趋化因子 受体结合.激活LFA-1;游出一淋巴细胞 归巣至淋巴结O舌化后的LFA-1与 富内皮细胞表

9、面的CAM-1紧誉结合；01环中的淋巴细胞 进入淋巴结高内皮A越化囚子受体/)000细/时间分辨荧光免疫测定法“流式细胞术最常用的组织细胞表面粘附分子的测定方法基本测定原理:将酶标记的抗特定粘附分子抗体与预处理 的组织切片标本共温浴一定时间，如组织细胞表面存在 相应的粘附分子，则酶标抗体即可与其结合；然后加入 酶底物显色，显微镜下观察结果。标本：组织切片引入BAS系统可以提高测定的灵敏度、酶免疫细胞组织化学法二、荧光免疫细胞组织化学方法基本原理和基本操作步骤同酶免疫细胞组织化学法区别：标记物一荧光素观察-荧光显微镜三、酶免疫测定方法（-）酶免疫显色测定法（又称为细胞-ELISA ）基本原理：吸

10、附于因相载体上的靶细胞，其表面的粘 附分子可与加入的酶标特异抗体结合，再加入酶显色 底物进行显色反应，显色深浅与细胞表面的特定粘附 分子的含量成正比检测标本：细胞引入BAS系统提高监测灵敏度（二）酶免疫化学发光测定法本法与酶免疫显色测定方法的原理、测定模式和测定 步骤基本相同区别点：显色反应时加入的是酶的发光或荧光底物，用发光检测仪或荧光检测仪。本方法灵敏度高于酶免疫显色测定方法酶免疫测定法的方法学评价优点：操作简单，测定方便、灵敏度高缺点：1存在内源性酶的干扰，造成较强的非特异性 显色2固定剂对细胞表面抗原物质造成一定破坏， 使非特异性显色增加可用于内皮细胞、淋巴细胞等细胞表面的粘附分子的测

11、*基本原理：锢系元素的螯合物作为标记物标记特异的抗 粘附分子抗体，当其与固相化靶细胞表面的相应粘附分 子结合后，可在紫外光激发下发出荧光， 荧光强弱与细 胞表面粘附分子的含量成正比。*测定标本：细胞特点:_J荧光信号测量的特异性高 /检测灵敏度高，达10T7(nol“避免放射性污染丁荧光标记有相对高的比活性/双标记技术提高了分析效率可用于内皮细胞、淋巴细胞等细胞表面的粘附分子的测定可实现多组分的同时检测五、流式细胞仪测定方法4_可溶性粘附分子的测定丄 ELISA （最常用）丄 RIA丄化学发光免疫测定丄时间分辨荧光免疫测定测定标本：血清或其他体液黏附分子基因多态性测定黏附分子基因表达的测定黏

12、PCR-单链构型多态性（PCR-SSCP） PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）（最常用） PCR-ASO （等位基因特异性寡核昔酸探针法） PCR-SSO （序列特异性寡核昔酸探针法） PCR-SSP （序列特异性引物分析法）实时荧光PCR PCR-DNA测序法（最直接） PCR指纹图法细胞黏附分子 mRNA 的测定 Northern 印迹杂交 RT-PCR基因多态性测定基因表达的测定 RNA 测定的关键：防止 RNA 的降解黏附分子测定的应用疾病发生发展机制的探讨炎症、肿瘤浸润转移、器官移植排斥、自身免疫病、免 疫缺陷病等疾病的临床诊断及预后指标血循环中可溶性ICAM-1和VCAM-1是最常用的特定疾病的 辅助诊断指标ICAM-1：