蛋白质分离纯化

1、一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质中的功能团 末端NH2 末端COOH 侧链基团所以，蛋白质的化学物理性质AA A蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。B蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。C结合蛋白质 辅基成分包含可解离蛋白质D末端-COOH, -NH2E蛋白质分子中可解离基团的pK和游离AA中相应基团的pK值完全不相同。在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响F蛋白质可看作一个多价离子 蛋白质等电点-在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点 等离子点-没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等离

2、子点。特征常数。二蛋白质分子的大小与形状二蛋白质分子的大小与形状 利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量利用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率 这样造成两个后果：SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。 改变了蛋白质单体分子的构象。 SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系( (七七) ) 毛

3、细管电泳测定蛋白质的分子质量毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（毛细管电泳（CECE）则可以在很大程度上克服常）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。以用积分仪或电脑联机精确定量。 ( (八八) )质谱测定蛋白质分子量质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其技术，其分辨率和精确度都较前几项技术

4、高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（以下的多肽；而电喷雾质谱（ESIESI）可以测）可以测5 5万万DaDa的蛋白质，而且只需要皮摩尔（的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmolpmol）量的蛋）量的蛋白质，精确度为白质，精确度为0.01%0.01%。三蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀1蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。分散程度-胶体系统分散相质点-真溶液（质点是分子，均相系统） 分散程度-以分散相质点的直径来衡量 根据分散程度： 分散相质点在胶体系统中保持稳定

5、需三个条件：分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件：a 分散相质点1-100nmb 分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀c 分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层蛋白质：蛋白质： a. 胶体质点的范围 c 丁达尔效应d 布朗运动e 不能透过半透膜2 2蛋白质的沉淀 沉淀蛋白质的方法： 盐析法： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等） 蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白质变性 有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 条件：低温操作 缩短时间 重金属盐沉淀法当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,P

6、b2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀用途：抢救误服重金属盐的病人生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液pHpI 蛋白质带电，溶解度较大pHpI 蛋白质带电，溶解度较大pHpI 1 不同蛋白质等电点不同 pI时溶解度最低将蛋白质彼此分开( (三) )根据电荷不同的分离方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。 1 1电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳(elecctropHoresis)(elecctropHoresis)或离子泳(ionpHoresis)(ionpHoresis)。区带电泳 是由于在支持物上电泳时各组分因迁移数度不同分布成区带而得名。按支持物介质的物理性状：四类区带电泳：1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳, 薄膜电泳)2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉3.细丝电泳:尼龙丝,人造丝4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼