聚合酶链式反应

1、聚合酶链式反应第一页，共26页。一、一、PCRPCR的定义的定义 在引物指导下由酶催化的在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组对特定克隆或基因组DNADNA序列序列进行的体外扩增反应。进行的体外扩增反应。第二页，共26页。 第三页，共26页。第四页，共26页。二、二、PCRPCR技术的优点技术的优点 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等好、易自动化等 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNADNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍第五页，共26页。三、三、PC

2、RPCR原理原理Sample1. denaturatation2. Primer annealing3. Primer extensionRegion to be copied第六页，共26页。PCRPCR技术原理技术原理类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。互补的寡核苷酸引物。模板模板DNADNA变性：变性：加热至加热至9494左右，双链左右，双链DNADNA解离成单链；解离成单链；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单单

3、链的互补序列配对结合；链的互补序列配对结合；引物的延伸：引物的延伸：在在Taq DNATaq DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP为原料，靶为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；条新的双链；重复循环重复循环变性变性-退火退火-延伸延伸三过程，使三过程，使DNADNA扩增量呈指数扩增量呈指数上升。上升。 第七页，共26页。目录目录n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第八页，共26页。1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温

4、延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第九页，共26页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95第十页，共26页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物第十一页，共26页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PC

5、R的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第十二页，共26页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始第十三页，共26页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq第十四页，共26页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束第十五页，共26页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增第十六页，共26页。PCR productPCR product第十七页，共26页。Target Amplif

6、icationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon第十八页，共26页。PCR仪第十九页，共26页。四、四、PCRPCR的标准反应体系的标准反应体系 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10l

7、4种种dNTP混合物混合物 各各200mol/L 引物引物 10100 pmol 模板模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5 ul （Mg2+） 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ulHomeHome第二十页，共26页。五、五、PCRPCR反应五要素反应五要素引物引物 （primerprimer）酶酶 （Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase） dNTP dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （templatetemplate） MgMg2+ 2+ （m

8、agnesiummagnesium）第二十一页，共26页。六、PCR的类型及应用1、 PCR的类型反转录PCR技术：RNA的反转录与PCR的联合应用原位PCR技术：在细胞内进行，不需要提取DNA实时PCR技术：进行DNA的定量分析筑巢筑巢PCR PCR 彩色彩色PCR PCR 多重多重PCR PCR 不对称不对称PCR PCR 共享引物共享引物PCR PCR 差异显示差异显示PCR PCR 锚定锚定PCR PCR 重组重组PCRPCR第二十二页，共26页。2、 PCR的应用 研究 -基因克隆、测序、分析突变 诊断 -细菌、病毒、寄生虫检测、诊断 人类基因组工程 -遗传图谱的构建、测序、表达图谱 法医 -犯罪现场标本分析 肿瘤检测 其他第二十三页，共26页。法医学法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。第二十四页，共26页。什么是“DNA指纹技术”？ 世界上除同卵双生外，几