单源抗体制备与应用ppt课件

1、單源抗體製備與應用單源抗體製備與應用李龍湖李龍湖國立中興大學獸醫學系教授國立中興大學獸醫學系教授95年年10月月12日日抗體抗體Antibody, Ab抗原抗原Antigen, Ag半抗原半抗原Hapten抗原決定位抗原決定位Epitope多價抗體多價抗體Polyclonal Ab抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子單源株、價抗體單源株、價抗體Monoclonal Ab抗體溶液中僅含一種抗體分子抗體溶液中僅含一種抗體分子抗原特異性抗體抗原特異性抗體monospecific Ab屬於多價抗體屬於多價抗體抗體共同確認特定抗原抗體共同確認特定抗原 抗體特性比較抗體特性

2、比較特性特性單源抗體單源抗體多價抗體多價抗體抗原特異性抗體抗原特異性抗體特異性特異性高高低低高高/低低濃度濃度高高低低低低供應限制供應限制無無有有有有單單 源源 抗抗 體體 發發 展展 背背 景景1. B細胞細胞 B細胞淋巴球是產生抗體的細胞細胞淋巴球是產生抗體的細胞 每一個每一個B細胞產生一種抗體分子細胞產生一種抗體分子 脾臟或淋巴結之細胞培養約脾臟或淋巴結之細胞培養約7天天 製造分泌標的抗體分子製造分泌標的抗體分子2. 骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞Myeloma cell, NS1, SP2 B腫瘤細胞自然發生腫瘤細胞自然發生 製造分泌未知抗體分子製造分泌未知抗體分子 可株化成株代細胞可株化成株代

3、細胞cell line3. 細胞交融技術細胞交融技術cell fusion 上述兩種細胞交融成交融瘤細胞上述兩種細胞交融成交融瘤細胞HybridomaMAb製備流程圖製備流程圖1. 細胞交融脾臟細胞骨髓瘤細胞細胞交融脾臟細胞骨髓瘤細胞抗原抗原 BALB/C小白鼠小白鼠 PEG交融劑交融劑培養液培養液RPMI 1640, DMEM HAT試藥試藥骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞NS1, SP22. 陽性細胞株篩選與確認陽性細胞株篩選與確認ELISA IFA Western blot雙重確認雙重確認3. 細胞株化細胞株化極限稀釋極限稀釋Limited dilution餵飼細胞餵飼細胞陽性細胞再確認陽性細胞再確

4、認4. 單源抗體定性單源抗體定性 Isotype 鑑定鑑定免疫沈澱和抗原特異性結合免疫沈澱和抗原特異性結合抗體濃度抗體濃度生物活性測定如中和作用生物活性測定如中和作用和抗原決定位結合線狀或構型抗原決定和抗原決定位結合線狀或構型抗原決定位位5. 單源抗體生產與純化單源抗體生產與純化A 細胞上清液搜集及抗體純化細胞上清液搜集及抗體純化 抗體濃度低小於抗體濃度低小於 1 mg/ml 不含胎牛血清培養液不含胎牛血清培養液B BALB/C 小白鼠生產抗體小白鼠生產抗體 Pristane處理，一週後注射交融瘤細胞處理，一週後注射交融瘤細胞 採集腹水，純化抗體採集腹水，純化抗體 抗體濃度高通常為數個抗體濃度

5、高通常為數個 mg/ml6. 細胞保管和解凍細胞保管和解凍保管液含胎牛血清和抗凍劑保管液含胎牛血清和抗凍劑10 % DMSO連續降溫連續降溫溫度越低，保管越久溫度越低，保管越久迅速解凍迅速解凍隔天觀察生長情形及換液隔天觀察生長情形及換液7. 細胞污染或生長不良處理細胞污染或生長不良處理黴漿菌污染黴漿菌污染抗生素，抗黴菌劑运用抗生素，抗黴菌劑运用小鼠腹腔接種小鼠腹腔接種單單 源源 抗抗 體體 應應 用用研讨研讨治療：濃度高，動物运用多治療：濃度高，動物运用多 免疫藥理學，免疫基治療等免疫藥理學，免疫基治療等檢驗試劑檢驗試劑 :病原病原 食品食品 藥毒物藥毒物蛋白質等蛋白質等實實 例例家禽家禽Re

6、ovirus非結構蛋白非結構蛋白NS抗原決定位分析抗原決定位分析細菌表現蛋白細菌表現蛋白NS免疫免疫 細胞交融細胞交融抗體篩選：抗體篩選：ELISA，間接螢光抗體染色，間接螢光抗體染色細胞株化及確認細胞株化及確認抗體定性抗體定性Table1. Properties of monoclonal antibodies directed against the nonstructural protein NS of ARV-S1133 *Concentration of ascitic immunoglobulin precipitated with ammonium sulfate was det

7、ermined according to Bio-Rad Standard Assay Procedures.N: Native NS PC: Polyclonal antibody D: Denature NS NC: Normal control serumV: Virus-infected cell extractsC: Mock-infected cell extracts1 to 10: Immunoprecipitates with MAbs 1: 47C, 2: 4A21, 3: 4A125, 4: 4A23, 5: 1F9, 6: 4B9, 7: Gall, 8: 4A123,

8、 9: 5F9, 10: H1E1Competition (%) = ( ) 100% A: OD without a competiting Ab B: OD with a homologous Ab n: OD with a competitorA nA BTable2. Results of competitive binding assay between monoclonal antibodies to ARV-S1133 nonstructural proteinNSCompetition more than 60%, +; competition between 35% and

9、60%, +; competition less than 35%, -. Epitope recognized by MAbs 5F9 and Ga11 was not classified (U).1. Poly(A)-sepharose + NS 2. NS + MAbs (1:5)3. NS + MAbs (1:500) 4. NS + MAbs (1:5000)5. Normal serum + NS 6. NS + anti-NS Ab 7. Sepharose + NS 8. Sepharose + NS + MAb1F9MAb capture ELISA for detecting Ab to ARV NS MAb 1E1Antigen1. Expressed ARV NS (eNS ) Coating MAb + Crude eNS preparation Coating pu