流式的原理及应用

1、流式的原理及应用流式的原理及应用杜欣康杜欣康BDBD生物科学，流式细胞仪技术支持生物科学，流式细胞仪技术支持电话：电话：1391599625113915996251邮箱：邮箱：Jack_duBD.comJack_duBD.com2什么是流式细胞术什么是流式细胞术3什么是流式细胞术什么是流式细胞术 流式细胞术（Flow Cytometry）是指利用流式细胞仪，通过检测细胞上/内特异标记的荧光信号，从而测定细胞的多种生化特性（表面受体、抗原、离子、DNA/RNA等的表达）的方法。4流式细胞术的特点流式细胞术的特点5流式细胞术的特点流式细胞术的特点 分析对象：任何直径50 m的颗粒，一般为单细胞悬液

2、6流式细胞术的特点流式细胞术的特点 分析对象：任何直径50 m的颗粒，一般为单细胞悬液 分析速度：快速，Calibur 2,000事件/秒7流式细胞术的特点流式细胞术的特点 分析对象：任何直径50 m的颗粒，一般为单细胞悬液 分析速度：快速，Calibur 2,000事件/秒 检测参数：多个（两个散射光，多个荧光参数）8流式细胞术的特点流式细胞术的特点 分析对象：任何直径50 m的颗粒，一般为单细胞悬液 分析速度：快速，Calibur 2,000事件/秒 检测参数：多个（两个散射光，多个荧光参数） 检测结果：精度高，准确性好，具有统计学意义9BDBD公司的分析型流式细胞仪公司的分析型流式细胞仪

3、10BDBD公司的分选型流式细胞仪公司的分选型流式细胞仪11流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构12流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构 液流系统收集细胞并使之与激光正交13流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构 液流系统收集细胞并使之与激光正交 光学系统激发和收集光信号14流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构 液流系统收集细胞并使之与激光正交 光学系统激发和收集光信号 电子系统把光信号按比例转化成电子信号15流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构液流系统液流系统废液桶废液桶鞘液桶鞘液桶上样针上样针流动室流动室激光正交激光正交16流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构液流液流样本样本样本样本鞘液鞘液鞘液鞘液鞘液鞘液鞘液鞘液

4、红激光红激光蓝激光蓝激光紫激光紫激光低流速低流速高流速高流速17流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构 流速：低速12 l/min中速35 l/min高速60 l/min18流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构光学系统光学系统19流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构长通长通接收器接收器带通带通长通长通+ +带通带通20流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构21流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构LaserLaserWavelengthWavelengthMin. PowerMin. PowerCommonly Used FluorochromesCommonly Used Fluorochromes(nm)(nm)(

5、mW)(mW)or Dyesor DyesBlue488 nm 13FITC, PerCP, PerCP-Cy5.5Red 633 nm 11APC, APC-Cy7, APC-H7Violet405 nm 30Pacific Blue, DAPI, BD Horizon V450 and V500Near UV375 nm 7Hoechst Red, Hoechst Blue, PI, DAPIYellow-Green561 nm30PE, PE-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Texas Red, mCherry, PE-Cy7, PIBlue-Violet445 nm20CFP, A

6、mCyan fluorescent protein22流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构23流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构电子系统电子系统光子光子接收器接收器光信号光信号转化为转化为电信号电信号电信号电信号处理处理电脑电脑24流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构电子系统电子系统25流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构 高（H）= 最大荧光强度 宽（W）= 时间 面积（A）= 总荧光强度26流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构27流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构28流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构29流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构30流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构31流式细胞仪操作的基本流程流式细胞仪操

7、作的基本流程32流式细胞仪操作的基本流程流式细胞仪操作的基本流程开机和液开机和液流启动流启动质控质控样本收集样本收集数据分析数据分析样本收集样本收集数据分析数据分析清洗和清洗和关机关机33流式分析样本的制备流式分析样本的制备34流式分析样本的制备流式分析样本的制备35流式分析样本的制备流式分析样本的制备 单细胞悬液的制备 目的分子的标记 样本过滤等待上机36流式分析样本的制备流式分析样本的制备37流式分析样本的制备流式分析样本的制备38流式分析样本的制备流式分析样本的制备39流式分析样本的制备流式分析样本的制备40流式分析样本的制备流式分析样本的制备41流式分析样本的制备流式分析样本的制备42

8、流式分析样本的制备流式分析样本的制备43流式常见的实验流式常见的实验44流式常见的实验流式常见的实验 荧光免疫 直接染色 vs 间接染色 强荧光配弱表达，强表达配弱荧光 染料数量不大时可以避免使用临近通道 通道间的溢漏（补偿）45流式常见的实验流式常见的实验 荧光免疫 强荧光配弱表达 强表达配弱荧光46流式常见的实验流式常见的实验 荧光免疫 什么是溢光？为什么要补偿？47流式常见的实验流式常见的实验48流式常见的实验流式常见的实验 荧光免疫 为什么要做同型对照和单阳管？49流式常见的实验流式常见的实验 荧光免疫（实例） CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 染色同型对照：PB 100L +Isotope FITC 20L+ Isotope PE 20L+ Isotope APC 5L 单阳管： PB 100L +CD4 FITC 20L+ Isotope PE 20L+ Isotope APC 5L 单阳管： PB 100L +Isotope FITC 20L+CD8 PE 20L+ Isotope APC 5L 单阳管： PB 100L +Isotope FITC 20L+ Isotope PE 20L+CD3 APC 5L 样品管： PB 100