WB技术服务报告模板

1、WesternBlot实验报告正式实验客户姓名：报告日期：一、客户样品及抗体登记1.样品种属来源：2.样品标记：组织细胞样品名称备注3.抗体名称：抗体来源：抗体Cat.及lot号:二、材料和方法1.试剂及耗材蛋白抽提试剂（改进型RIPA配方）BCA®白定量试剂盒2mg/mlBSA标准品5X还原样品缓冲液10xTris-Glycine-SDS电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液10XTBSTpH8.0中分子量蛋白marker（7条带）中分子量预染蛋白marker（7条带）湿转缓冲液NC膜，0.45um孑L径Millipore丽春红染色液BSAAmrescoPMSFAmresco蛋白酶抑制剂Roc

2、he磷酸酶抑制剂Roche脱脂奶粉伊利ECLMilliporeStrippingbuffer（抗体洗脱液）（抗体需要选择，选择后把多余的删除）山羊抗兔IgG（H+D,HRPJackson山羊抗小鼠IgG（H+D,HRPJackson兔抗山羊IgG（H+L），HRPJacksonBeta-actin兔多抗Beta-actin鼠单抗Beta-tubulin兔多抗Beta-tubulin鼠单抗GAPDFfe多抗GAPDK单抗2实验仪器Fresco低温冷冻离心机ThermoMultiSkan3酶标仪ThermoMiniP-4电泳槽Cavoy湿转电泳槽Cavoy电泳仪Bio-Rad半干槽Bio-Rad水

3、平脱色摇床其林贝尔酸度计pH211Hanna电动组织匀浆器Fluka三、实验方法及结果3.1 蛋白抽提3.1.1 组织蛋白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制齐J）。在蛋白抽提开始前加入0.1MPMS附液，PMS眼浓度1mM称取组织重量以重量：裂解液体积=1:9比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块，Fluka电动组织匀浆器15000rpm转速进行匀浆，每次10s,间隔10s,进行三次匀浆。匀浆时EP管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20min,4度离心，13000rpm,20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。3.1.2 细胞蛋

4、白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入0.1MPMS附液，PMS照浓度1mM细胞计数，以细胞数量1X107加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min,4度离心，13000rpm,20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。3.2 BCA法蛋白定量准备BCAT作液A液：B液=50:1,稀释好各个提取BSA标准品。样品用PBS进行稀释。样品：BCAT作液=1:8,混匀后37度孵育30min或者室温孵育60min,酶标仪570nm波长滤光片读取ODfi。蛋白浓度计算见下表:3.3 蛋白浓度调整以RIPA

5、调整蛋白浓度，加入5X还原样品缓冲液后样品终浓度为2-4mg/ml（不同样品具体确定）。煮沸变性5min。样品蛋白浓度调整见下表：3.4 SDS-PAGE3.4.1 根据目的蛋白的分子量，配制12剂离胶，浓缩胶浓度为5%3.4.2 待检测蛋白样品上样量：上样20ug3.4.3 电泳条件：浓缩胶包压90V,约20min,澳酚蓝进行分离胶界面；分离胶包压160V,电泳至澳酚蓝到凝胶底部。3.4.4 用考马斯亮蓝染色液进行染色。染色结果见下图：3.5 目的蛋白WBE式实验3.5.1 根据目的蛋白的分子量，配制分离胶，浓缩胶浓度为5%3.5.2 待检测蛋白样品上样量：3.5.3 电泳条件：浓缩胶包压9

6、0V,约20min；分离胶包压160V,通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。3.5.4 湿转法，转膜条件：300mAs流；0.45um孔径NC膜，转膜时间h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。同时做好泳道标记，准备预实验时进行按照纵向泳道剪膜。3.5.5 封闭：将膜完全浸没5%兑脂奶粉-TBST中室温轻摇60min。3.5.6 一抗孵育：用5%兑脂奶粉-TBST稀释稀释一抗,室温孵育10min,放4c过夜。膜编号一抗名称稀释比例稀释后体积备注：按照预实验中确定的稀释度进行正式实验选择一种内参进行同步预实验。3.5.7 第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：T

7、BST光月M5次，每次3min。3.5.8 二抗孵育：用5%兑脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+DHRP山羊抗小鼠IgG（H+DHRP,1:10000,室温轻摇40min。洗膜：TBST洗月16次，每次3min。3.5.9 ECL加到膜上后反应3-5min,胶片曝光：10s-5min（曝光时间随不同光强度而调整），显影2min,定影。胶片扫描后结果如下：3.6 内参蛋白WBE式实验3.6.1 StrippingBuffer洗膜，37c洗膜30min（如果目的蛋白与内参蛋白分子量相差在10K以上，可以不用strippingbuffer洗膜这一步）。3.6.2 洗膜：去离子水洗膜3次。3.6.3 洗膜：TBST洗月13次，每次3min3.6.4 将膜完全浸没3%BSA-TBST室温轻摇30min。3.6.5 孵育内参：加Beta-actin兔多抗，用5%兑脂奶粉-TBST稀释抗体，1:3000稀释，室温孵育2h。3.6.6 洗膜：TBST洗月15次，每次3min。3.6.7 二抗孵育：用5%兑脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+DHRP山羊抗小鼠IgG（H+DHRP,1:10000,室温轻摇40min。洗膜：TBST洗月16次，每次3min3.6.8 洗膜：TBST洗月15次，每次3m