微生物检测技术--金黄色葡萄球菌检测

1、食品的微生物学检验食品的微生物学检验致病菌致病菌主要内容主要内容n金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（GB4789.10-2010）n大肠杆菌（大肠杆菌（GB 4789.38-2012）n沙门氏菌（沙门氏菌（GB 4789.42010）n 副溶血性弧菌（副溶血性弧菌（GB 4789.72013 ）金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验 p153n1、生物学特性、生物学特性 （重点）（重点）n2、致病性、致病性n3、流行病学、流行病学n4、国标检验方法、国标检验方法 （重点）（重点）n5、快速检测方法、快速检测方法1、生物学特性、生物学特性1.1形态与染色形态与染色v金黄色葡萄球菌无芽孢，无鞭毛，金黄

2、色葡萄球菌无芽孢，无鞭毛，大多数无荚膜大多数无荚膜v革兰氏染色革兰氏染色阳性阳性；v典型的金黄色葡萄球菌为球型，直典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径径0.8m左右，显微镜下排列成葡左右，显微镜下排列成葡萄串状。萄串状。1.2 培养特征培养特征v易培养，易培养，对营养要求不高，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。在普通培养基中生长良好。v需氧或兼性厌氧，在好氧条件下生长最好；需氧或兼性厌氧，在好氧条件下生长最好；v大多数菌株能生长在大多数菌株能生长在6.5-46之间（之间（最适温度最适温度30-37）能在能在pH4.2-9.3之间生长之间生长（最适（最适pH为为6-7）；）；v耐盐性强，耐盐性

3、强，在含在含715%的氯化钠培养基中仍能生长，可的氯化钠培养基中仍能生长，可用于用于筛选菌种筛选菌种。v在普通营养琼脂平板上培养在普通营养琼脂平板上培养1824，可形成圆形、表面，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素金黄色色素，色素为脂溶性，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。v溶血：红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，溶血：红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。简称溶血。v溶血素是细菌分泌的一种毒性因子溶血素是细菌分泌的一种毒性因子血平板：血平板：可形成可形成完全透明溶

4、血环完全透明溶血环（ 溶血溶血）细菌的溶血现象v根据细菌对红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型及现根据细菌对红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型及现象：象： v溶血溶血: :产生溶血素，产生溶血素，不完全性溶血不完全性溶血，在血琼脂平皿上菌落，在血琼脂平皿上菌落周围有周围有1 12mm2mm，较窄，较窄半透明半透明的的草绿色草绿色溶血环。溶血环。 v溶血溶血: : 呈呈完全性溶血完全性溶血，在血平皿上菌落周围有，在血平皿上菌落周围有2 24mm4mm宽、宽、界限分明、无色界限分明、无色透明透明的溶血环。的溶血环。 v溶血溶血: :不产生溶血素，在血琼脂平皿上的菌落周围无溶血不产生溶血素，在

5、血琼脂平皿上的菌落周围无溶血环。环。v可产生可产生卵磷脂酶卵磷脂酶，在卵黄高盐培养基上形，在卵黄高盐培养基上形成周围有成周围有白色沉淀环白色沉淀环的菌落。的菌落。1.3 生化反应生化反应v大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，糖，产酸不产气。产酸不产气。v分解分解甘露醇甘露醇，产酸。，产酸。2、致病性v金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，为条件金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，为条件致病菌。可引起局部致病菌。可引起局部化脓化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。甚至败血症、脓毒

6、症等全身感染。葡萄球菌皮肤感染v菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素溶血素：外毒素，分外毒素，分、多种，能损伤血小板，破坏溶酶体，多种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用

7、。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。五种。2、致病性v+当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经如牛奶和奶制

8、品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。小时即可相当数量的肠毒素。肠毒素肠毒素可耐受可耐受100度煮沸度煮沸30min而不被破坏。人摄食该污染产品后而不被破坏。人摄食该污染产品后2-3h便可出现中便可出现中毒症状。其引起的食物中毒典型症状为呕吐和腹泻。毒症状。其引起的食物中毒典型症状为呕吐和腹泻。3、流行病学v在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。物的排泄物中都可找到。v作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，动物的鼻腔、咽喉、头

9、发上，50%以上健康人的以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受因而，食品受其污染的机会很多。其污染的机会很多。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，

10、对肉体其他部位的污奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。染。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学 近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。仅次于大肠杆菌。 +金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占，加拿大则更多，占45%，我国，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。每

11、年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学4、GB 4789.102010食品安全国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验v1 1 范围范围v本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌（本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus）的检验方法。）的检验方法。v本标准本标准第一法第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；的定性检验；v第二法第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄适用于金黄色葡萄球菌含量较

12、高的食品中金黄色葡萄球菌的计数；球菌的计数；v第三法第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。品中金黄色葡萄球菌的计数。检验前准备工作检验前准备工作采集与送检采集与送检预处理预处理菌落总数菌落总数大肠菌群大肠菌群致病菌致病菌纯化纯化分离培养分离培养前增菌前增菌多项鉴定及检测实验多项鉴定及检测实验分析、报告分析、报告食品微生物检验的一般程序食品微生物检验的一般程序检测步骤-增菌v利用金黄色葡萄球菌利用金黄色葡萄球菌耐盐耐盐的特性（可耐受的特性（可耐受15%的氯化钠），用含的氯化钠），用含7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤

13、蛋白胨蛋白胨 10.0 g牛肉膏牛肉膏 5.0 g氯化钠氯化钠 75 g蒸馏水蒸馏水 1 000 mL检测步骤-增菌v或或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤（污染严重时）氯化钠胰酪胨大豆肉汤（污染严重时）胰酪胨（或胰蛋白胨）胰酪胨（或胰蛋白胨） 17.0 g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3.0 g氯化钠氯化钠 100.0 g磷酸氢二钾磷酸氢二钾 2.5 g丙酮酸钠丙酮酸钠 10.0 g葡萄糖葡萄糖 2.5 g蒸馏水蒸馏水 1 000 mL检测步骤 -分离v血平板血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。血平板上产

14、生明显的溶血环。v血平板上其血平板上其典型菌落典型菌落呈呈金黄色金黄色，有时也为白色，大，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。 血平板血平板vBairdBairdParkerParker琼脂平板琼脂平板( (BP平板平板) )v胰蛋白胨胰蛋白胨 10.0 gv牛肉膏牛肉膏 5.0 gv酵母膏酵母膏 1.0 gv丙酮酸钠丙酮酸钠 10.0 gv甘氨酸甘氨酸 12.0 gv氯化锂氯化锂 5.0 gv琼脂琼脂 20.0 gv蒸馏水蒸馏水 950 mLv卵黄亚碲酸钾增菌剂卵黄亚碲酸钾增菌剂 50 mL 检测步骤 -分离检测步骤-分离vBP

15、平板平板：胰蛋白胨胰蛋白胨、牛肉膏牛肉膏和和酵母膏酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和痕提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素量矿物元素丙酮酸钠、甘氨酸丙酮酸钠、甘氨酸和和氯化锂氯化锂是一种生长促进剂是一种生长促进剂亚碲酸盐亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色并使菌落产生黑色卵黄卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环提供营养和有利于观察卵磷脂环检测步骤-分离v在在BP平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，直径平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，颜色呈，颜色呈灰色到黑色灰色到黑色，边缘常为淡色

16、（米黄色或灰白色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带混浊带(沉淀环沉淀环)，在其外，在其外缘缘常有一透明圈常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。B-P平板检测步骤-鉴定v染色镜检染色镜检v金黄色葡萄球菌可以产生金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶凝固酶，使血浆中纤维，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面 ，产产生凝固。生凝固。因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。酶。血浆凝固酶试验： 吸取吸取1:41:4新

17、鲜兔血浆新鲜兔血浆0.5 mL0.5 mL，放入小试管中，再加入培养，放入小试管中，再加入培养24 h24 h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5 mL0.5 mL，振荡摇匀，振荡摇匀， 置置 363611温箱或水浴内，温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察每半小时观察一次，观察6 h6 h，如，如呈现凝固呈现凝固, ,即将试管倒置或即将试管倒置或 倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。结果报告v如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡如血

18、浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌萄球菌 。v报告在报告在25g25g（mLmL）样品中检出或未检出金黄色样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。葡萄球菌。361 18 h24 h GB 4789.10-2010第一法第一法BHI 肉汤和营养琼肉汤和营养琼脂小斜面脂小斜面血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验检样检样:25 g(mL)样品样品+225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤，均质氯化钠胰酪胨大豆肉汤，均质Baird-Parker 平板平板,血平板血平板涂片染色涂片染色观察溶血观察溶血报告结果报告结果36 1 18 h24 h增菌增菌分离分离鉴定鉴定u1关于金黄色葡萄球菌关于金黄色葡萄球菌 ,下列哪种说法是错误的下列哪种说法是错误的uA. 耐盐性强耐盐性强 B. 革兰阳性菌革兰阳性菌uC. 在血琼脂平板上形成完全透明的溶血环在血琼脂平板上形成完全透明的溶血环uD.分解葡萄糖产酸产气分解葡萄糖产酸产气u2以下属于以下属于金黄色葡萄球菌的特点金黄色葡萄球菌的特点有有uA. 血浆凝固酶试验阳性血浆凝固酶试验阳性 B. 产生溶血素产生溶血素uC. 分解甘露醇分解甘露醇 D. 产生耐热核酸酶产生耐热核酸酶u3金黄色葡萄球菌的培养特性是金黄色葡萄球菌的培养特性是uA.营养要求高营养要求高 ，必须在血平板上才能生长，必须在血平板上才能生长