微生物技术实验

1、微生物技术实验 产黑色素菌株的分离、选育和发酵产黑色素菌株的分离、选育和发酵真黑色素真黑色素(eumelanins)棕黑色素棕黑色素( phaeomelanins )异黑色素异黑色素(allomelanins)神经黑色素神经黑色素(neuromelanins)脓黑色素脓黑色素(pyomelanins)黑色素黑色素(melanin) 广泛分布在动物、植物、真菌及细菌中的一类重要色素广泛分布在动物、植物、真菌及细菌中的一类重要色素 基本单体及氧化还原产物基本单体及氧化还原产物 二级结构模型图二级结构模型图 结构复杂、非均质、异源多聚的芳香族化合物结构复杂、非均质、异源多聚的芳香族化合物 研究背景研

2、究背景黑色素的分布及基本特征黑色素的分布及基本特征 黑色素的研究概况黑色素的研究概况 黑色素广泛存在于生物界中的一类从红色，黑色素广泛存在于生物界中的一类从红色，褐色到黑色的天然色素褐色到黑色的天然色素Natural red to black pigmentsNon-toxicity to environment and animals 黑色素含有自由基，这在天然物质中很少黑色素含有自由基，这在天然物质中很少见，而且它能象海绵一样吸收环境中的自见，而且它能象海绵一样吸收环境中的自由基由基 SEMAngel et al. J Immunol Methods 2000Lopez-Serrano e

3、t al. Microbiology 2007黑色素的类型及其合成途径黑色素的类型及其合成途径 真黑色素：多巴途径真黑色素：多巴途径 棕黑色素棕黑色素 ：酪氨酸氧化为多巴后，有半：酪氨酸氧化为多巴后，有半胱氨酸参与反应胱氨酸参与反应 异黑色素异黑色素 ：植物和微生物：植物和微生物 脓黑色素：尿黑酸途径脓黑色素：尿黑酸途径 神经黑色素神经黑色素 ：脑中产生：脑中产生 黑色素的研究概况黑色素的研究概况黑色素生物功能黑色素生物功能人体中，黑色素的种类和含量不同，造成头发、皮肤、眼睛颜色的差异。人体中，黑色素的种类和含量不同，造成头发、皮肤、眼睛颜色的差异。 防御功能防御功能乌贼和章鱼释放的墨汁作为烟

4、幕弹躲避捕食者。真菌细胞在感染过程中合成黑色素抵抗人体的免疫机制 。 抗辐射作用抗辐射作用黑色素有助于机体抵抗紫外线及其它各种辐射黑色素有助于机体抵抗紫外线及其它各种辐射，具有黑色孢子的真菌比无色孢子的真菌更能抵抗紫外线和太阳光的辐射。具有黑色孢子的真菌比无色孢子的真菌更能抵抗紫外线和太阳光的辐射。动物皮肤中的黑色素的产生是对紫外线辐射伤害的一种反应，它是目前动物皮肤中的黑色素的产生是对紫外线辐射伤害的一种反应，它是目前所知道的唯一的保护皮肤免受辐射伤害的天然生物聚合物。所知道的唯一的保护皮肤免受辐射伤害的天然生物聚合物。 外表修饰功能外表修饰功能 神经系统多种疾病与黑色素产生缺陷相关神经系统

5、多种疾病与黑色素产生缺陷相关如着色性干皮病，帕金森氏病，老年性痴呆症，亨廷氏舞蹈病等。如着色性干皮病，帕金森氏病，老年性痴呆症，亨廷氏舞蹈病等。 清除自由基和活性氧物质清除自由基和活性氧物质能不断吸收环境中的自由基，从而对生物体提供保护。能不断吸收环境中的自由基，从而对生物体提供保护。 阻止病毒的感染阻止病毒的感染黑色素具有选择性抗病毒活力，能阻止黑色素具有选择性抗病毒活力，能阻止HIVHIV病毒、流感病毒对动物细胞的感染病毒、流感病毒对动物细胞的感染黑色素的研究概况黑色素的研究概况细菌黑色素合成关键酶细菌黑色素合成关键酶 酪氨酸酶酪氨酸酶酪氨酸酶的生化性质及生理功能 酪氨酸酶（酪氨酸酶（EC

6、 1.14.18.1EC 1.14.18.1），广泛存在于），广泛存在于动物、植物及微生物中动物、植物及微生物中 特殊之处：同时具有两种不同的催化活性：特殊之处：同时具有两种不同的催化活性：以单酚物质如酪氨酸为底物的单酚氧化酶以单酚物质如酪氨酸为底物的单酚氧化酶的活性，又称甲酚酶活性；以双酚物质如的活性，又称甲酚酶活性；以双酚物质如左旋多巴为底物的双酚氧化酶的活性，又左旋多巴为底物的双酚氧化酶的活性，又称为儿茶酚氧化酶活性称为儿茶酚氧化酶活性 酪氨酸酶研究前沿酪氨酸酶研究前沿酪氨酸酶的的结构 酪氨酸酶研究前沿酪氨酸酶研究前沿a)Octopus dofleini 血蓝血蓝蛋白；蛋白；b)Limu

7、lus polyphemus 血蓝蛋白血蓝蛋白c)Lpomoea batatas儿茶儿茶酚氧化酶；酚氧化酶；d)castaneoglobisporus(链霉菌链霉菌)酪氨酸酶；酪氨酸酶；e) 四个活性位点的重叠说四个活性位点的重叠说明四种蛋白活性中心具明四种蛋白活性中心具有高度的结构相似性。有高度的结构相似性。 1.1.合成左旋多巴和黑色素合成左旋多巴和黑色素 : :帕金森病帕金森病 等；等； 2.2.食品工业方面食品工业方面褐变：色泽褐变：色泽 3.3.有机合成及化学修饰有机合成及化学修饰 4.4.应用于生物传感器应用于生物传感器 ：检测酚类等：检测酚类等 酪氨酸酶的应用酪氨酸酶的应用 酪氨

8、酸酶研究前沿酪氨酸酶研究前沿实验步骤 分离产黑色素的细菌分离产黑色素的细菌 诱变育种诱变育种 发酵生产黑色素发酵生产黑色素 分离产黑色素的细菌分离产黑色素的细菌 在自然界中，土壤是微生物生活的大本营，是人类开发利用微生物资源的重要基地。分离微生物的策略分离微生物常用的方法： 稀释平板分离法和划线分离法实验步骤：实验步骤： 1、 土样采集点的确定： 要求采集地具有代表性，能代表该地主要土壤类型和主要植被类型。2、 土壤取样方法：将表层土铲去5-10cm，用干净的采样铲取约50g土，每个采样点至少取10处，并将所采土样装于无菌塑料袋中混合，然后把样品置通风阴凉处碾碎。 3、 菌的分离：称10g土样

9、于水中，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20分钟，使土样与水充分混合，并使细胞分散。用一支1 ml无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推做10倍稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6稀释液0.1ml涂布平板。28培养3天。4、 纯化：挑取产黑色素(包括红至褐色素)的单个菌落接种斜面，同时作涂片检查，若有不纯，应进一步挑取此菌落采用划线分离或制成菌悬液作稀释分离，直至获得纯培养。5、 复筛：将纯化的菌种在筛选平板上划线，28培养2天。6、 菌株性质鉴定 菌落特征观察在筛选平板上产黑色素菌落的特征。 革兰氏染色显微

10、镜观察 产黑色素的性质观察挑选菌株所产黑色素的基本性质。 产黑色素的性质观察挑选菌株所产黑色素的基本性质。 诱变育种诱变育种获得获得营养缺陷型（生物素）高产黑色素的菌株高产黑色素的菌株 实验原理 基因突变是微生物诱变育种的理论依据。生物经理化因子的处理可以提高基因突变的频率，因此采用物理因素或化学因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，以提高突变频率和扩大遗传变异的幅度，然后从中筛选出所需要的突变菌株，这便是诱变育种诱变育种。其中在营养上表现出某种缺陷的变异菌株，叫做缺缺陷型菌株陷型菌株。它是遗传学研究和遗传育种工作中不可缺少的重要材料。亚硝基胍（亚硝基胍（NGNG或NTGNTG）是一种广泛

11、使用的强诱变剂。它主要在DNA链的复制区引起G:C A:T转换，即使在杀菌率很低的情况下也能诱发高频率的突变。对于细菌的处理一般通过制作杀菌曲线，采用杀菌率在70%-90%的诱变剂量处理微生物为好。 本实验采用亚硝基胍对分离菌株进行诱变。主要用点种法和影印法检出缺陷型菌落，并用生长谱法进行鉴定，获取生物素营养缺陷型高产黑色素的菌株。 诱变育种诱变育种 培养基LBLB培养基（完全培养基）：培养基（完全培养基）：蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml，pH7.0-7.2基本培养基基本培养基MMMM：(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 7g，KH2PO4 3g，柠

12、檬酸钠 0.5g，MgSO47H2O 0.1g，葡萄糖 5g，蒸馏水 1000ml，pH自然（7.0）CuTYCuTY培养基：培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 诱变育种诱变育种实验步骤 1、制备菌悬液 挑取少许斜面菌种接种于盛有5ml LB液体培养基的试管中，28振荡培养过夜。 取0.5ml培养液转入另一盛有5ml LB液体培养基的试管中，28振荡培养6-7小时。2、制作平板将LB固体培养基融化，倒平板，凝固后待用。 3、 涂平板 取0.1ml 上述菌液放到LB培养基平板上

13、，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面。 4、 诱变 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶，然后将平板倒置于培养箱中28培养24小时。 在放亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈。 5、 涂布平板 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到装有4.5ml生理盐水的试管中，摇匀，制成处理后菌悬液。 取上述菌悬液0.5ml于盛有4.5ml生理盐水的试管中，稀释到10-4。分别取10-1、10-2、10-3和10-4稀释液涂布LB平板，每个平板涂0.1ml，经诱变处理的稀释液每稀释度涂布3个平板，置28培养两天。 ( (凡是有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用凡是有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用1N N

14、aOH1N NaOH溶液溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。注意不要浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。注意不要让含有让含有NGNG的上清液滴在皮肤或衣物上的上清液滴在皮肤或衣物上) ) 6、营养缺陷型的检出 点种法 取基本培养基(MM)和完全培养基(LB)平板，作好成对与方向的标记(即一皿MM和一皿LB为一对)，将事先已编号的格子纸分别放在两培养皿的底部。用无菌牙签小心地在待测菌落表面挑取少许细胞，分别点在MM和LB培养皿的对应位置上(先点MM，后点LB)。尽可能多点些菌落。置28培养两天。 影印法 取无菌MM、LB培养基各一皿，在平皿底部画箭头作为方向标记。选择一个菌落分散

15、的培养皿作为母平皿，作如上标记，并在影印板上也作同样标记。 将母平皿对好标记倒放在影印板的绒布上，然后轻轻放下，立即把MM培养皿对好标记倒放在影印板下，取下MM培养皿，再印Cu-TY培养板。 28培养两天左右。 夹层法 取无菌培养皿3皿，各倒一薄层( 约5 ml )MM培养基，凝固后加入0.1 ml经诱变处理的10-5倍稀释液，再加入约5 ml的MM培养基，摇匀，凝固后再盖上一层约5 ml的MM培养基。待凝固后置28培养两天左右。 取出上述培养平板，在皿底把已长出的菌落作好标记，统计其菌落数，再盖上一层约5 ml的半固体LB培养基。置28培养两天。 上述三种方法中，在MM培养基上不长而在LB培

16、养基上生长的菌落可能是缺陷型菌株，需要进一步复证。7、将可能为缺陷型的菌落编号，分别接入5ml LB液体培养基中，28振荡培养过夜。 8、营养缺陷型的鉴定 初步鉴定取0.1 ml培养液涂布在MM培养基上。待干后：皿底按图分成三个区域，并分别标上A(混合氨基酸)，V(混合维生素)和B(碱基混合物)。在每一区域中央分别对应地加入混合氨基酸、混合维生素和碱基混合物。置28培养两天后，区别该菌属于哪一类缺陷型。 准确鉴定按上述方法，将初步测定为某一类缺陷型的菌株制成菌悬液，涂布在MM培养基上。在皿底划分区域，划分的区域数和需添加的生长因素编组数相同。按区域对应地加入编组混合物。碱基的种类较少，可单一地

17、加入，不必分组。28培养两天后观察结果。 9、 产黑快慢的比较 将鉴定的营养缺陷型菌株与出发菌株分别在CuTY平板上划线，比较各个菌株产生黑色素的快慢，置28培养两天。之后选取高产黑色素的菌株进行发酵。 表1 初测结果（用“+”表示生长） 菌落编号添加物1234567氨基酸维生素碱 基表2 准确鉴定结果 菌落编号菌落生长区缺陷的营养物质12345 发酵生产黑色素发酵生产黑色素 现代意义的发酵主要是利用微生物对周围环境极大的适应能力、极强的消化能力和繁殖能力等特点，通过发酵罐大量繁殖微生物来制备所需产品。 发酵工业的生产流程一般是：保藏斜面活化斜面摇瓶种子种子罐发酵罐，小型实验可以略去种子罐一步

18、。 本实验中主要使用摇瓶进行发酵条件的实验。发酵生产过程中要随时观察菌体生长情况。本实验与生产中菌浓度的测定方法一样，采用分光光度计法。 发酵培养基发酵培养基 FW FW发酵培养基：发酵培养基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，NaCl 5g，MgSO4 1g，L-酪氨酸 1g，水1000ml，pH7.0； CuFWCuFW发酵培养基：发酵培养基： 在1000ml FW发酵培养基中加入CuCl2 0.1mM ； TY TY发酵培养基：发酵培养基： 葡萄糖 1 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，氯化钙 0.1 g， 酪氨酸 1 g，水1000

19、ml，pH7.0 CuTY CuTY培养基：培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 发酵生产黑色素发酵生产黑色素实验步骤实验步骤 1、菌种活化取保藏斜面菌种划线接种于CuTY平板，28培养24小时。2、种子培养 接一单菌落至装有5mL液体LB培养基的试管中，28振荡培养24小时。 3、 发酵培养 将上述培养液1ml分别接种到四种装有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，8层纱布封口，28、200rpm的恒温摇床上培养。4、取样每隔24小时取4ml的发酵液，离心后取上清液用 721

20、型分光光度计测 OD400值。OD400值表示各实验菌株产黑色素状况，结果填入表3。菌体沉淀用4ml的蒸馏水悬浮后测 OD600（菌浓度）。直至培养96小时结束。 5、 发酵终止培养至72小时为发酵终止，进行黑色素的测定和提取。比较各种发酵培养基的异同。黑色素的提取 ：将发酵液pH调至 8.0，离心 (3000rpm 20分钟)去菌体，取上清调 pH至3-4，静置 l0分钟，离心 (3000rpm， 20分钟) 取 黑色沉淀烘干。表3 突变菌株在不同发酵培养基中产黑色素的变化 培养基FWCuFWTYCuTY24h-OD40048h-OD40072h-OD40096h-OD400黑色素产量（mg

21、/ml）思考题1）你是否获得了比出发菌株黑色素产量更高的突变菌株？试分析其可能的原因。2）观察黑色素产生的时间，并计算最终黑色素的产量。试分析你的实验结果，并提出改进方案。分分 解解 步步 骤骤 分离产黑色素的细菌分离产黑色素的细菌 菌株性质鉴定 产黑色素的性质观察挑选菌株所产黑色素的基本性质。 菌落特征观察在筛选平板上产黑色素菌落的特征。 革兰氏染色显微镜观察革兰氏染色显微镜观察 诱变育种诱变育种 培养基LBLB培养基（完全培养基）：培养基（完全培养基）：蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml，pH7.0-7.2基本培养基基本培养基MMMM：(NH4)2SO4

22、 1g，K2HPO4 7g，KH2PO4 3g，柠檬酸钠 0.5g，MgSO47H2O 0.1g，葡萄糖 5g，蒸馏水 1000ml，pH自然（7.0）CuTYCuTY培养基：培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 诱变育种诱变育种准备工作 1、每组准备如下器皿： 平皿 至少42个； 玻璃吸管（1ml至少15支，5ml至少12支）；牙签2包(70 x2)；影印板2个2、第一条桌子的同学（12人）准备每组6支装有4.5ml生理盐水的试管每组10支装有5ml LB液体培养基的试管每组

23、200ml LB固体培养基 11-133、第二条桌子的同学（12人）准备每组200ml MM固体培养基每组150ml CuTY固体培养基全班共20个组 诱变育种诱变育种实验步骤 1、制备菌悬液 挑取少许斜面菌种接种于盛有5ml LB液体培养基的试管中，28振荡培养过夜。2、制作平板将LB固体培养基融化，倒平板，凝固后待用。 11-13实验完毕请清理桌面！今天第1和2组同学做清洁。3、 涂平板 取0.1ml 上述菌液放到LB培养基平板上，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面。 4、 诱变 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶，然后将平板倒置于培养箱中28培养24小时。 在放亚硝基

24、胍的位置周围将出现抑菌圈。 11-14 9:005、 涂布平板 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到装有4.5ml生理盐水的试管中，摇匀，制成处理后菌悬液。 取上述菌悬液0.5ml于盛有4.5ml生理盐水的试管中，稀释到10-4。分别取10-1、10-2、10-3和10-4稀释液涂布LB平板，每个平板涂0.1ml，经诱变处理的稀释液10-1、10-2和10-3每稀释度涂布3个平板，置28培养两天。 ( (凡是有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用凡是有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用1N NaOH1N NaOH溶液溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。注意不要浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后

25、清洗。注意不要让含有让含有NGNG的上清液滴在皮肤或衣物上的上清液滴在皮肤或衣物上) ) 11-15 9:00LB平板10个6、营养缺陷型的检出 点种法 取基本培养基(MM)和完全培养基(CuTY)平板，作好成对与方向的标记(即一皿MM和一皿CuTY为一对)，将事先已编号的格子纸分别放在两培养皿的底部。用无菌牙签小心地在待测菌落表面挑取少许细胞，分别点在MM和CuTY培养皿的对应位置上(先点MM，后点CuTY)。尽可能多点些菌落。置28培养两天。 11-17 4:30CuTY和MM平板各2个 影印法 取无菌MM、 CuTY培养基各一皿，在平皿底部画箭头作为方向标记。选择一个菌落分散的培养皿作为

26、母平皿，作如上标记，并在影印板上也作同样标记。 将母平皿对好标记倒放在影印板的绒布上，然后轻轻放下，立即把MM培养皿对好标记倒放在影印板下，取下MM培养皿，再印CuTY培养板。 28培养两天左右。 11-17CuTY和MM平板各2个上述三种方法中，在MM培养基上不长而在LB培养基上生长的菌落可能是缺陷型菌株，需要进一步复证。7、将可能为缺陷型的菌落编号，分别接入5ml LB液体培养基中，28振荡培养过夜。 11-19 4:305 ml LB液体试管 2支8、营养缺陷型的鉴定 初步鉴定取0.1 ml培养液涂布在MM培养基上。待干后：皿底按图分成三个区域，并分别标上A(混合氨基酸)，V(混合维生素

27、)和B(碱基混合物)。在每一区域中央分别对应地加入混合氨基酸、混合维生素和碱基混合物。置28培养两天后，区别该菌属于哪一类缺陷型。 11-20 8:00MM平板2个11-20 准备工作准备工作第三条桌子的同学（第三条桌子的同学（1616人）准备人）准备每组每组4 4种发酵培养基各种发酵培养基各50ml50ml液体培养基液体培养基 FW FW发酵培养基：发酵培养基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，NaCl 5g，MgSO4 1g，L-酪氨酸 1g，水1000ml，pH7.0； CuFWCuFW发酵培养基：发酵培养基： 在1000ml FW发酵培

28、养基中加入CuCl2 0.1mM ； TY TY发酵培养基：发酵培养基： 葡萄糖 1 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，氯化钙 0.1 g， 酪氨酸 1 g，水1000ml，pH7.0 CuTY CuTY培养基：培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 准确鉴定按上述方法，将初步测定为某一类缺陷型的菌株制成菌悬液，涂布在MM培养基上。在皿底划分区域，划分的区域数和需添加的生长因素编组数相同。按区域对应地加入编组混合物。碱基的种类较少，可单一地加入，不必分组。28培养3天后观察结

29、果。 12-09 4:30MM平板2个9、 产黑快慢的比较 将鉴定的营养缺陷型菌株与出发菌株分别在CuTY平板上划线，比较各个菌株产生黑色素的快慢，置28培养3天,每天观察产黑色素快慢。之后选取高产黑色素的菌株进行发酵。 11-24 4:30CuTY平板2个表1 初测结果（用“+”表示生长） 菌落编号添加物1234567氨基酸维生素碱 基表2 准确鉴定结果 菌落编号菌落生长区缺陷的营养物质12345 发酵生产黑色素发酵生产黑色素 现代意义的发酵主要是利用微生物对周围环境极大的适应能力、极强的消化能力和极强的繁殖能力等特点，通过发酵罐大量繁殖微生物来制备所需产品。发酵工业的生产流程一般是：保藏斜面活化斜面摇瓶种子种子罐发酵罐，小型实验可以略去种子罐一步。本实验中主要使用摇瓶进行发酵条件的实验。发酵生产过程中要随时观察菌体生长情况。本实验与生产中菌浓度的测定方法一样，采用分光光度计法。 发酵培养基发酵培养基 FW FW发酵培养基：发酵培养基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，NaCl 5g，