激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解

1、激光川描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope)激光扫描共聚共显微tft(lascrscanningconfocalmicroscope).英文简写LSCM,俗称confbcaLLSCM足一神高科技显微或，属J,最先进的细饱生物学分析仪曙.我们学院便用的是瑞上供K公司(Leica)的TCSSP5型号的LSCM.使用流程1、登陆即W10.31.60.139或5号楼606室公用电脑卜我激光共聚焦预约使用审核表，打印并填写。2、联系卢剑清(手机审核井卷名。3,持已签名的激光共聚焦开(约使用审核表至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙,

2、联系人:窦凯飞(手机.4 .在熟练使用者的指导下，进行实验.5 .实聆结束,及时归还饵匙仪器构造和原理LSCM的柒木结构上要包括荧尤显微俄系统及样品台、激光发射如扫描得、依测SS、图像"储处理和输出设备,计算机控恸系统.激光光源：激光扫描束转质明柱孔形成点光源,普通显微健来用的白然光或灯光是一种场光源.M本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散见光的扰c向LSCM以激光为光源,激光具有单色性强.方向性好.高亮度.相干性好等优点，可以避免普通显微镜的块点.一般常用的气体激光器加总(Ar).找(Kr)、加Nc).illuminatingpinhole(照明针孔

3、):使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源II有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与deleterpinhole(探沌器针孔)及焦平面形成共聚悠装花.分光值(BeamSpHttcrh点光源发出的光势分光镜反射后,通过物傥在样品聚出.对标本内愈平而上的衍一点进行扫描,Focalplane(保平面)s激光点光源制射物体在焦平面处聚£"激发荧光标记的样木发射荧光，形成焦点光斑.该光应经过物盘和分光慷等一系列装置的处理，分别在1M此CL及探测针孔两处聚焦。共聚焦的含义由此向来。昧本上的被照射点所发射的荧光沿同一光路进入物镜，穿过分光

4、信后在探到骨孔处成像.该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡.然后经探测针孔后的光电信炳管(PMT)或冷电感件合爆件(cCCD)逐点或逐城接收,将光信号转变为电信号，传箱至计算机，迅速在屏幕上形成荧光图像。PMTD«KtorDiciwoteConfocdA|»nuieSourceLSCM是在荧光院微傥的基础上用激光作扫描光源.逐点.逐行、逐血快速扫描成像扫描的激光1荧光收集共用一个物镜，物镜的康点即扫描激光的聚集点.也是瞬时成像的物点.由于激光束的波长较短，光束於弱，所以共聚焦激光扫描显做俄口较高的分辨力.大约是普通光学显微值的3倍。系统经一次调焦，扫描限储在样品的一个平面内

5、。调你深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像.这些图像信息都储于计算机内.通过计算机分析和模拟就能显示细阑样枯的立体结构.Bi'尤Q人=«*»苏M仪器用途1.原位签定细胞或组织内生物大分子,观察细胞及亚细胞形态结构：在细胞原位检测核验原位依测蛋白时抗体及其他分子检测细胞凋亡细胞器观察及测定依测细胞融合观察细胞骨架检测细胞内脂肪2、活体细胞或组统功能的实时动态监测：实时定所测定细胞内Ca2+的变化测定细胞内PH变化e测膜电位的变化检测细胞内活性加物种的产生怆测药物等胎膜进入组织或细胞过程及其定位检测荧光共振能年转移(FRET)检测荧光漂白恢复(FRAP)样品制

6、备1 .组织切片林本实收标本要求单层，并能很好地贴附在样M池中©所以，邠织标本无论是石蛾切片还是浓冻切片，均为越薄越好.2 .细胞标本细胞种类和纯度，细胞密度和形态。3 .承载细胞的器皿Petri皿和玻片.操作步骤一、开机1 .依次打开电脑桌右蝴'PCMicroscope"、"SeannsPower"及"LaserPower”二个圆形按钮，然后将“LaserPower，按钮右费|的激光开关钥匙(LaserEmission)顺时针旋转90度至3加1”位置.记录开机时间.2 .打开显微境电源,及荧光电源。3 .双击电眄显示屏里面上的“LAS

7、AF闺标启动株卡共聚焦软件。4 .如需使用快扫系统，在“ActivateResonantScanner'选项前打勾©5 .点击PK,以打开软件.打开后显示LASAF密"界面.三、在显微饿卜观察样品1 .选界合适的物境,可通过显微位主机在伽的物位轧换按钮，或软件中的Pbjectives”健进行选抨.2 .将样品置于我物台匕在明场条件卜选择合适的视野。通过显微能上机右侧的按钮进行调焦，以及显微镜主机左便的TN功能键调节光强.3 .按叮I/L”功能键转换至荧光观察方法，通过显微镜前面板的按钮选择介适的荧光口蚁，进行样M的荧光观察。4 .观察兑华后，按显微值而面板上的荧光S

8、HUTTER,健以保护样品.一八采集共聚焦图像1 .点击T具栏卜方的PonGguraiiofT.再点击“Laser用对勾打开所需激光.如需使用Ar离子激光，拖动滑块温节激光输出功率.激光激发波长405Diode405nmAigou458.476.488.514mnHeNe543543nmDPSS561561nmHeNe633633mu2 .点击“Aquire”进行光路设置。调用已有的设置：选择“Load/Savesinglesettin葭下拉菜单中已有的设置(激光及其摘出功率.分光信,检测波长范围、PMT的gain及。附el),常用的荧光染料都已包含在内.选择某一设置后,可按样从的实际常要对参

9、数进行优化(如后述)，并以新的名称保。修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测的围、调节PMT的gain或offset等。建立新的设甘：也可从零开始建立新的设置.选界所需激光及其功率、适宜的分光镜、PMT及检测波长范困。对双重或多重染色的样品，可选择同时采图或序列采图的方式。推荐使用后者，因其可避免染料交叉激发和串色导致的结果不准确。进行序列扫描而，需分别设置用一通道的采图参数.3 .透射光检测甥的选择单曲,AdditionalChannel，”以显示透射光检测器LPMTTrans”)，选择观察方法(BF.DIC等)。4 .选择扫描模式在“Ac

10、quire”菜单栏的“Acquisition”中选择扫描模式("AcquisitionMode”)。默认模式为xyz扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy扫描和z轴层切(xyz扫描)。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由x,y,2,t(时间)以及九(波长)组合而成的多维扫描模式,如xzy.xyt,xy人.xyzt,xyzX,xyzlt等.5 .设置扫描参数在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中设置扫描参数,包拈分辨率pixelformats灯描速度(scanningspeed)>针孔大小(pinholesize)线平均(lineaveraging)而平均(fra

11、meaveraging)、累加(accumulation)及放大倍数(zoom)等.分辨率：默认值为512x512。也可选择更低或更高分辨率分辨率越高，所获取的图像文件也越大扫描速度：默认值为400Hz,活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描("bidirectionalscanning)来达到更高速度，这时可能需要进行相位(母hase”)调节,一/针孔大小：默认值为lAiry.如果样品的荧光非常如，可通过增大针孔直径来增加信号强度，但所获取图像不是真正的共聚焦图像，平均：用于降低背景噪音分为“Lineaveraging*5(线平均)和“Frameaveraging

12、”(面平均)，线平均较快，可在下拉菜单.中选择平均的次数°两种平均方式可结合使用°累加：仅用于荧光非常弱的样品.6 .预览图像点击“Liv/以设定的扫描参数预览图像，图像将显示在右侧的显示屏上。7 .优化扫描参数预览图像时，调节z轴位宜找到最适合观察的焦平面，并调节PMT的电压(PMTgam)及偏移(PMT。抵et),或激光愉出功率使图像达到最佳,可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数.理想的荧光图像中应该只有少数象素点达到饱和(即灰阶为255),可通过位于图像左便的LUT按钮进行观察LUT按钮可在LUT(即指定的荧光颜色)、“GlowOverUnder(GlowOU)”和灰

13、度图三档之间切换在GbwOU中.灰阶为255的象素点以不为苣色，而灰阶为0的软素点显不为绿色，调节PMT的电压使图像中仅少数象素点显示蓝色.应使用较低的激光输出功常和较高的PMT电压值，这有助于保护样品免受光漂白的影响.可通过调节PMT的偏移值来降低图像的背景。荧光图像PMT偏移的默认把为0%,且调节过程中不应使其大于(>%对透射光图像.同样可以调节透射光PMT的电压和偏移值来进行优化，但时可将偏移位训至高0%以增加对比度©图像调至满意后，单击“Stop”终止预览过程.8 .采集图像单击。pturcImage”采集图像在此之前可改变分辨率、线湎平均次数等扫描参数。通常情况卜，预

14、览图像时选择512*512的分辨率，而采集图像时可增加至1024x1024。四、序列扫描如果样品采用两种或以上荧光染料标记，为避免申色对实验结果的影响，可采用序列扫描的方式.1 .单ilTAcqukition”中的teq”按钮，软件界而中将出现一个序列扫描菜单，可通过,ScanI”右侧的，中诲加更多的扫描序列eScan20,Scan3M2 .调用所需的单一采图设置，预览并优化参数至满意后，点击飞can1”将参数定义至笫一扫描序列.3 .同法定义“Scan2”及更多的序列。4 .扫描顺序“bclwecnlincs”适合大多数的应用，特别是活细胞成像。5 .调整分辨率、线/面平均次数等扫描参数后，

15、点击“Start”进行序列图像的采集。6 .可保存序列扫描的设置以使将来调用。五.z轴层切（xyz扫描）z轴层切用于观察样品中目标的空间分布。Lxyz扫描模式为默认采图模式.2 .选择ZGalvo”，HfSupcrZ进行z轴调节；或，Wkc”,用显微镜物价进行z轴调节。3 .设置采图参数，方法同前。4 .点击“Live”进行图像预览用控制而板的二PositiorT旋钮调节z轴至层切所需的起点，点由“Begin”上方的果色箭头定义层切起点（带头变为棕色表示一定义）：调节z轴至层切所需的终点，点击“End”上方的黑色箭头定义层切终点。5 .点击“stop"终止图像/CIKY/SzSjnH

16、6 .此时xyz层切菜单中显示的2Scpsize”（相邻两个光切面的间距）和“Nr.ofsteps”（层切数H）为系统的优化值（"systemoptimized"）。也可点击“Nr.ofsteps”左他的按钮，然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义.7 .点JTStart”进行xyz图像的采虬8 .采图完毕后，应点击"BegnT和“End”上方的棕色箭头，使其变为黑色，重新处于未定义状态.六、时间序列扫描（xyt扫描）时间序列扫描多用于活细胞成像,记求动态过程。1 .在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择xyt扫描模式后，将出现xyt扫描菜

17、根2 .设置采图参数，方法同前。3 .定义FimcInicrvar,即采集相邻两帧图像所需的时间间隔,也可选择最小fTMinimizcL4 .按采图需要选择“Acquireimlilslopped"、“Duration'或"Frames'；若选择“Acquireuntilstopped”，则图血将持续采柒,直至手动终止若选择,DuratiotT,可定义采图所需的总时间.若选择“Frames"，可定义所需的图像帧数.5 .点击“Apply”确定.6 .点击“Start”进行时间序列图像的采集。七、波长扫描（iy入扫描）波长扫描常用T自发荧光或新染料发

18、射光谱的检测o1 .选择激发光，方法同前。2 .在“Acquire”菜单栏的“AcquisitiorT中选择xy1扫描模式后，将出现波长扫描菜单3 .定义“Begin”（需检测的发射谱起点）和“End”（击检测的发射谱终点）.起点所在波长应大于激发波长。4 .定义“BandWidth”（接收的带宽），通常为lOnnv5 .定义“No.ofsicps”（采集的帧数）或“LambdaSlcpsizc”（波长步进）（波长步进不应大于接收带宽。6 .选择所用PMT。7 .点击“Start”进行波长图像的采集八、关机1 .保存已采集的图像2 .关闭显微镜汞灯电源.3 .若使用过油镜，需用无水乙醛与无水乙

19、醇混合液（体积比7：3）或无水乙醉清洁镜头。4 .关闭LASAF软件.5 .将电脑集右侧“LaserPower”按钮几侧的激光开关例匙（LaserEmission）逆时计旋转90度至Pn（T位置。6 .关闭“ScannerPower”按钿°7 .4电脑卜.进行图像数据的输出注意：使用空白光盘刻录，而不得使用任何其他形式的移动存储介质。8 .关闭电脑后，关闭“PCMicroscope”按钿.9 .风扇停止后（关闭激光开关钥匙约15分钟后），关闭“LaserPower”按钮。记泉美机时间、仪踞状况等信息。问题补充:一.如何提高图像质在I）.通过减慢扫描速度.2）,使用,平均，方法3）.增

20、加发射池镜的带宽4）、加大针孔直径；注意：光学切片的厚度也会相应地增大。5）、增大激发能（激光功率）；注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应.6）、使用较高数值孔径（NA）的物位7）、增加出大小”=每条线的像素侑十每帧的线条数。8）、优化打描出距（Z）。9）、烟加动态范困。11）、使用多轨.。12）、提供预定义配置。13）、可同时定义和使用任何形状的多人研究区。二,避免或排除光滑交叉干扰的方法：1）、同时使用几种荧光探针时，尽量选择相互之间无光谱交叉的荧光探计。2）、降低标记荧光强度。（采用降低标记物浓度、缩短标记时间、训整探针介质等方法）.3）、采用顺序扫描方法克服光谱交叉.4）、改变检测仪器条件.5X荧光光错饕别法.三、八种观察方式：明场观察、喑场观察、浮歌相衬、彼