植物组织培养实验指导1

1、植物组织培养实验指导植物组织培养实验指导的相关说明、本指导用于植物组织培养概论课程的实验教学。各专业班级根据实际情况做相应调整，调整情况详见各专业班级的授课计划。其中15个课时的内容调整如下：实验一、二、五3学时实验六3学时实验七3学时实验九、实验十二3学时实验十三3学时33实验一实验室基本设备及其用途的识别目的认识植物组织培养实验室的基本结构，必须的基本设备及其用途与作用方法。实验室的基本结构（一） 化学实验室（工作室）培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析；制蒸馏水。设备、药柜、工作台、蒸馏水器、天平、冰箱，手提高压消毒锅、显微镜、解剖镜、各种玻璃仪器、金属仪器等

2、。安装水、电、排气等装置。（二）接种室无菌操作室接种箱超净工作台（三）培养室（四）洗涤、消毒室；卧式高压消毒锅。（五）温室（培养大棚）。实验二常用仪器、必要器皿、几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制1、 目的认识植物组织培养必需的仪器、器皿，几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制。2、 常用仪器1. 蒸馏水器（学习操作）2. 手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅（学习使用、操作）3. 天平 药物天平（工业天平）、粗天平、（精密度1/10）扭力天平（精密度1/100）分析天平（精密度1/10000）4. 超净工作台（学习、使用、操作）5. 电热干燥箱（烘箱）6. 恒温光照培养箱（学习、操作

3、）7. 电冰箱8. 显微镜和解剖镜 手提式解剖镜（学习、使用、操作） 立体解剖镜 普通显微镜9. 旋转培养机10. 离心机（学习、使用、操作）11. 酸度测定仪： 精密PH4 7试纸； 笔型 袖珍酸度计。3、 必要的器皿（一）玻璃器皿1. 培养器皿 试管 三角烧瓶（锥形瓶） 圆形高形培养瓶（罐头瓶） 培养皿 扁身培养瓶 L 型和 T 型管 凹面载玻片2. 盛装器皿 试剂瓶 烧杯3. 计量器皿 量筒 容量瓶 吸管4. 其它器皿滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。（二）金属器械1. 镊子类 20 25cm 长型镊子（接种或转移愈伤组织） 尖端弯曲“枪型”镊子（镊取较小的植物组织）

4、尖头钟表镊子和鸭嘴镊子（剥离表皮用） 尖端为小铲状镊子（挖取带琼脂培养基的培养物）2. 解剖刀和刀类 眼科用刀种牛痘疫苗的菱形刀（切割柔软组织中小细胞团） 解剖刀（手术刀） 双面刀片焊接在玻棒上（切取茎尖用） 锋利小刀、大刀和小铁锹3. 剪刀类 解剖 剪 眉剪 眼 科 剪 18 25cm 弯头剪修枝剪4. 接种针 四、几种常用药剂的配制（一）用95%尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制。学习配制70%和 75%酒精。（二）消毒剂1. 20%次氯酸钠溶液称取20g次氯酸钠用少许水溶解，100ml水定容。2. 0.1%升汞（HgCl2）溶液 称取0.1g HgCl2少许水溶解，100ml水定容。（三）

5、洗涤剂1. 2HCl 酒精95%酒精100ml 加入 2mlHCl2. 硫酸重铬酸钾洗液称取10g重铭酸钾加入蒸储水90ml,加热溶解冷却后，逐渐加入浓硫 酸175ml,放入棕色玻璃瓶备用，（注意：切记不可将盛过洒精，甲醛等原剂 的药品玻璃器皿直接泡入洗液在，因为重铬酸钾是一种强的氧化剂，一旦被还原氧化，洗液变绿，失去洗涤作用）。这些器皿必须用自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液。（四）1 摩尔浓度（mg/L ）NaOH 和 1 摩尔浓度（mg/L） HCl 配制。摩尔浓度是指用1升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度。用M 表示。1. NaOH 摩尔浓度（M）NaOH 摩尔质

6、量 =分子克数 =40g1M NaOH是指1000ml溶液中含有40克摩尔质量的NaOH,现要配制100ml 40X0.1=4g称取NaOH4g,用少量溶解，定容100mL2. HCl 的摩尔浓度具体配制酸的mol 浓度时，应考虑原浓酸的比重mol 浓度。要求配制的mol浓度x需配制的体积x原酸分子量V =原酸的百分浓度x原酸的比重x 1000配制1.0M HCl 100ml,量取38%,比重为1.19的HCl8.06ml加蒸储水，定 容至 100ml 。实验三洗涤灭菌植物组织培养能否成功重要的一环是在无菌条件下进行操作与培养，导致污染的来源主要有： 器皿和用具； 培养基； 培养材料； 工作人

7、员 本身； 操作时的空气。防止污染的有效方法是将所有与培养有关的器皿，用具、培养基、接种室、培养室等进行灭菌和无菌操作。一、洗涤（一）玻璃器皿的洗涤1. 新购置的玻璃器皿的洗涤（学习、操作）因有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。2. 已用过玻璃器皿先将残渣除去；用清水洗净，再用热肥皂水或洗衣粉洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。3. 对一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗，自来水冲干净后，晾干， 再浸入硫酸重铬酸钾洗液中浸泡若干小时，用夹子取出在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲

8、洗1 3 遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。4. 对带有凡士林，石蜡，或胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。 带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去，再用汽油擦洗干净，然后用热肥皂水煮沸半小时，刷洗后，自来水冲干净。若带有石蜡，可在玻璃器皿下垫几层废纸，放入60 70温箱中1 加热 2 小时， 待石蜡融化后，再用废纸反复擦2 3 次即去石蜡再泡入洗衣粉的热水中洗干净最后用自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净若有胶布粘着物，先用70%酒精棉球擦数遍，溶解粘胶物，并用少许去污粉刷抹，再用洗衣粉煮沸半小时，刷洗干净，自来水冲洗，晾干，再泡入洗液。（二 ）金属器皿新购置金属器皿因其上有润滑油或防

9、绣油，用蘸有四氯化碳（CCl 4 ）布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。二、灭菌（一）器皿和用具常用灭菌方法：1. 热压灭菌法（学习操作）将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1 压力下灭菌20 30 分钟。2. 干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，150 40 分钟或120两小时，待冷却后使用。（二）无菌室灭菌（接种室、培养室）1. 用新洁尔灭擦抹工作台，70%酒精擦拭超净工作台。2. 薰蒸（学习操作）用甲醛、 高锰酸钾提前1 3天薰蒸密封房间方法1： 甲醛倒入蒸发皿加热，用量10ml/m2。方法2:甲醛（HCHO）与高钮酸钾（KMn4）以10： 1比例混合。3.

10、 接种前用70 75%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。4. 用紫外光灯进行照射灭菌（波长2650 2660A 最好）接种箱及用具 30 40 分钟。（三）培养基灭菌（略）（四）培养材料灭菌（略）（五） 工作人员无菌操作（略）实验四培养基（一）培养基成分介绍一、培养基的成分是影响组织培养的最根本的外部因素。对某种植物培养成功与否是各种条件综合影响的结果。这些综合因素存在于每一个培养步骤。每一个单因子都可能导致培养的失败。影响培养效果的因素分有外因和内因，外因有培养基成分及物理状态，培养温度，光照强度，光的质及波长等等。这五种最根本的是培养基成分，因为它是培养材料的生命之地，它若适宜。培养则

11、易成功，反之则失败。二、培养基的成分（一）大量元素植物生长必须的C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg 九种元素在植物组成中含量较多，通常占干重或灰分的千分之几，百分之几，所以在培养基中用量较大叫大量元素，大量元素H、 O 两种元素主要从水中获得，C 从光合作用CO2来，但离体植物或组织没有光合作用能力。因此通过加糖提供C 源，常用浓度为15%,常用分析纯、化学纯的蔗糖。N常用硝态N （硝酸钾等）和钱态 N（硫酸铵等）大多数以硝态N 为主。 MS 培养基和N6 培养基既含有硝态N 又含有铵态N， P 参与植物生命过程中的核酸合成，蛋白质合成，光合作用，呼吸作用及能量贮存，转化和释放等重要生理生

12、化过程。K 在近代培养基中，用量有提高的趋势，Ca、 Mg、 S 的需要则较少。能提供 这 些 元 素 的 物 质 主 要 有 磷 酸 二 氢 钾 （ KH2PO4） ， 七 个 结 晶 水 的 硫 酸 镁（ MgSO4.7H2O） ，二个结晶水的氯化钙（CaCl2.2H2O） 。（二）微量元素包括 Fe 、Cu、Mo （车目）、Zn、Na、Mn、Co （钻）、B （硼）和 I （碘），它们在植物组织培养基中需要量极微，体内含量常在10 3 10 5 moi/L 之间， 培养基中添加10 7-10 5moi/L （摩/升）就可满足需要，多了就会引起植物细胞酶失活，代谢障碍，蛋白质变性及组织死亡

13、。Fe 是用量较多的一种微量元素，对植物组织叶绿素的合成和延长生长起重要作用。因使用Fe （SO4）3 （硫酸铁）和FeCl3 （氯化铁）在培养基PH为5.2以上时Fe （OH）3沉淀，植物材料无法吸收， 故常用FeSC4.7H2O （硫酸亚铁）和二乙钱四乙酸二钠（Na2-EDTA）结合成螯合 铁成为有机态被吸收和利用。Cu 有促进离体根生长的作用；Mo 是合成活跃的硝酸还原酶的组成部分，也是周N酶的组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作用；Mg、Zn、Na、是酶的组成部分，也是防止叶绿素被破坏的作用；Mn 与植物呼吸作用、光合作用有关；B 与糖的运输，蛋白质合成有关，总之，微量元素在生命活动中，

14、多以酶系中的辅基形成起重要作用。（三）有机营养1. 维生素类：大多数植物组织或细胞能够合成必要的维生素，但是在数量上显然是不够的，通常在培养基中补加一种或多种维生素但各标准营养培养基所用维生素组合差别较大，常使用的有：维生素Bi （盐酸硫钱素）维生素B6 （盐酸叱哆醇）用量 0.1 5.0mg - L用量 0.1 1.0mg - L11维生素H （生物素）烟酸肌醇核黄素抗坏血酸泛酸钙、叶酸用量 0.01 1.0mg - L 1用量 0.1 5.0mg - L 1用量 100200mg - L 1用量 0.1 1.0mg - L 1用量 1 100mg - L 1用量 0.5 2.5mg - L

15、 12. 氨基酸：是重要的有机N 源，有甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬酰铵，水解酪蛋白（CH） ，水解乳蛋白（LH） ，它们主要作为营养提供，以利于蛋白质合成，CH和LH是近二十种氨基酸的混合物，常用量 100 1000mg L-13. 有机添加物是一些成分较复杂，大多数含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但成分大多不清楚，含量也不稳定，所以一般应尽是避免使用，特别是新的生长调节剂物质不断产生，更缩小它们的使用范围。 椰乳（ CM） ：液体胚乳，一般浓度10 20% 香蕉：用量20-200g L 1黄熟的小香蕉加入培养基后即变紫色，对PH 的缓冲作用影

16、响很大，主要于兰花组培。 马铃薯，去皮去芽后用量150200g lT,切碎，30煮分钟，过滤液,加入培养基，对PH 有缓冲作用。 其他还有酵母提取液（YE） ，用量约0.5%；麦芽提取液用量0.1 0.5%苹果汁、番茄汁、柑桔汁等。（四）琼脂是一种从海藻中提取出来的凝胶性物质，作固体培养基凝固剂用，一般用浓度 0.6 1%，视琼脂质量而异。因天然产物，牌号，批号不同，质量差异大，用量亦有所差异，有时还有一些有害物质，用前要浸洗琼脂以色白，洁净为好。（五）糖糖是碳源，提供营造新细胞，新的化合物的碳骨架，也为组织呼吸代谢提供底物及能源，还能维持培养物所需渗透压。植物组织培养中提供碳源的糖类有蔗糖、

17、葡萄糖、 果糖是最好的碳源，多数植物在芽分化时糖用量为30g - L 1,根分化时用15 20g L，但也有高达50 -60 g - L 1,培养基筛选等项研究工作时，为避免出现误差而影响实验效果， 最好用纯度较高的蔗糖，实际生产中，完全可以用市集的白糖代替化学纯的蔗糖。（六）活性炭加入活性炭目的是除去琼脂中的毒物或培养物产生的芳香族的代谢废物，活性炭可防止组织变褐并利于胚胎发生与生根培养，活性在制造方法和来源不同，差异较大，一般用量0.1 0.5%。（七 ） 植物生长调节物质植物生长调节物质是培养基中关键物质，对植物组织培养起着生根而又明显的调节作用，没有哪一种比植物调节剂所生产的影响更大，

18、它用量的多少，配比的适当程度，将影响培养的成败，即影响到愈伤组织的生长，形态建造，根和芽的分化等等。目前已知的生长素，赤霉素，细胞分裂素，脱落酸和乙烯五大类植物激素，几乎都与分化有关。在植物组织培养中，生长调节剂，尤其是生长素和细胞分裂素非常重要可以说没有生长调节就不可能进行植物组织培养。生长素常用2.4 D,蔡乙酸（IAA）,呷咪乙酸（NAA）,呷咪丁酸（旧A）等， 其生理作用主要是促进细胞生长，刺激生根，对愈伤组织的形成起关键作用。细胞分裂常用激动素（KT） ， 6苄基氨基嘌呤（BA） ，玉米素（ZT） ， 2异戊烯腺喋吟（Zip）,它们经高温高压灭菌后性能仍稳定。 SLKT受光易分解,

19、故应在4-5C低温黑暗下保存，细胞分裂素有促进细胞分裂和分化，延长组织 衰老，增强蛋白质合成，抑制顶端优势，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用 的特点。通常认为，生长素和细胞分裂素的比值大时，有利于根的形成；比值小时， 则促进芽的形成。低浓度2.4-D有利于胚状体的分化，但妨碍胚状体进一步发 育，NAA有利于单子叶植物分化，旧A诱导生根效果最好。赤霉素（GA）的生理作用是促进植物伸长，节间伸长，分生组织芽生长， 诱导淀粉的合成，打破休眠和促进开花等，与生殖器官发生有关，一般不常用。脱落酸是植物体天然存在的生长抑制物，有促进叶部脱落，诱导休眠作用， 与生殖器官发生有关。乙烯是植物内唯一呈气体状态

20、的激素，与植物衰老和成熟有关。植物营养培养基中常用的植物生长调节剂类别名 称缩写词分子量使用浓度范围母液配制说明生 长 素2, 4二氯苯氧乙酸2, 4-D221.00.001 10mg/L生长素通常 用NaOH溶 液滴至溶解 成溶液。能溶于乙醇IAA 易被植 物细胞所氧 化。故培养基 中很少单独 使用。a 蔡乙酸NAA186.20.001 10mg/L口引噪一3一乙酸IAA175.20.001 10mg/L引噪一3丁酸IBA203.20.001 10mg/L细 胞 分 裂6苇基氨基喋吟BA225.2分裂素通常 能溶于稀NaOH,含水 乙醇或稀盐 酸玉米素不耐 热，不能高压 灭菌。6糠基氨基喋吟

21、KT215.2N异戊烯氨基喋吟（玉米素）ZT219.2赤 霉 素赤霉素GA3346.4能溶于乙醇不耐热不能 高压灭菌在 愈伤组织和 悬浮培养物 的启动和保 持生长时才 需要有时小 植株再生时 也需要2、 PH 的调整培养基的PH 值（酸碱度）直接影响对离子的吸收，所以过酸或过碱都对植物材料有很大影响。此外， 琼脂培养基的PH 值还影响到凝固情况最好用酸度计，若无也可用精密PH 试纸（干燥保存）过酸用1N NaOH调节，过碱用1N HCl调节， 经高压灭菌后，由于某些成分的分解（如蔗糖分解）或氧化， 酸度会增加，PH 一般可降低（0.2） ，培养基PH 一般调至5.6 5.8的范围。三、培养基中

22、采用浓度单位计量有：1 .毫克开（mg/L 或 mg - L 1）每升溶液中所含某化合物的毫克重。2 .微克开（ug/L 或 ug L-1）每升溶液中所含某化合物的微克重。3 .重量百分率：每100ml溶液中含某化合物的克重如：2%表示1000ml溶 液中含化合物20g,采用琼脂和蔗糖时常用此单位。4 .克分子重量（mol L 1即mol/L） mol每升溶液中所含某化合物的克分子重（mol） ，此种单位常用于生长调节剂，按用量不同，又分毫克分子重（mmol L 1）和微克分子（umol L 1）。5 . 容积百分率：100ml 溶液中含有某化合物的毫升量，常用于表示椰子乳汁，番茄汁、马铃薯汁

23、等。3、 实验操作内容：1. 棉球塞制作2. 无菌接种操作练习3. 分装培养基练习4. 容量瓶定容练习实习五培养基母液的配制一 . 培养基的种类培养基的种类,成分直接影响到培养材料的生长,故应根据培养植物的种类、部位选择适宜的培养基。养基0（一 ） 高盐成分培养基：包括MS、 LS、 BL、 BM、 ER 等培养基，它应用最广泛，其钾盐，铵盐及硝酸盐含量均较高，微量元素种类齐全，目前植物组织快繁中，应用MS 培养基最多。（二）硝酸钾含量较高的培养基1 B5 培养基B5 培养基除含有较高的钾盐外，还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫铵素，较适应南洋杉，葡萄和大豆科，十字花科植物的培养。2 N6培养基

24、 N6培养基（朱至清等）1975年我国学者创造，获国家发明二等 奖，适用于单子叶植物花药培养，柑桔花药培养也适合，楸树、针叶树等的组织培养使用效果也好。3 SH 培养基此培养基是矿盐浓度较高的培养基，其中铵与磷酸是由NH4H2PO4 提供的。（三）中等无机盐含量的培养基1 H 培养基（Bourgin 与 lNitsch）大量元素为MS 培养基的一半，仅KH 2PO4及氯化钙稍低，微量元素种类减少，而含量较MS 为高，维生素种类比MS多，适于花药培养。2尼奇培养基（Nitsch） 与 H 培养基的成分基本相同，仅生物素较H 培养基高 10 倍，也适于花药培养。3.米勒培养基（Miller）, B

25、laydes培养基适合于大豆愈伤组织培养和花药培养用。（四）低无机盐培养基，大多数情况下用于生根培养基1改良怀特培养基（White）2 WS 培养基（Wolter and skoog）3 .克诺普液（sknop）花卉培养上用得多4贝尔什劳特液（Berthelot）5. HB （Holley and Baker）花卉培养，木本植物的茎尖培养效果良好，其成分是大量元素比1/2 克诺普液稍多，微量元素用贝尔劳什特液，每升培养基中加0.5ml二培养基的选择所培养的植物已有前人作过研究的，可以从文献中找到可供采用的合适培养条件； 若前人从未培养过，就要选择和建立一个最适于该植物的营养培养基。可采用一种已

26、知培养基如 MS、B5或SH,对少数成分进行改变；进行一系列试验， 在修改一种培养基时，对无机成分和有机成分分别处理。在植物组织培养基中最可变的因素是生长调节剂，尤其是生长素和细胞分裂素，具体方法：首先选择好一种基本培养基（MS）对生长素（NAA）和细胞分 裂素（BAP）均分别制定大约五种浓度 0,0.5,2.5,5,10叱mol（微克量）将这两 种调节剂的五种浓度进行排列组合便可以得到25 个组合的试验性培养基，从 25个培养基中挑选出最好的培养条件（2） 进一步选择最合适的生长素和细胞分裂素 （浓度均与最适条件浓度相同）方法是先保持其中的生长素不变。只改变细胞分裂素的类型，反之亦然。虽然高

27、盐培养基（MS 等）从许多植物系统中已证明是良好的，但是有些培养物在低盐培养基上生长得更好，因此值得花精力去检验一下在最适生长调节剂组合下改变MS 的无机盐浓度为1/2 和 1/4水平，从而可以找到最好的无机盐尝试和最适生长调节剂组合的营养培养基。三培养基母液配制为了减少工作量，减少多次称量所造成的误差，一般将常用药品配成比所需浓度高10 100 倍的母液，现以MS 培养基为例，预先配制，四组不同母液，说明母液的配制方法。MS培养基母液配制（单位：毫克mg）母液成分规Ah里浓缩倍数称取量母液体积配制1升培养基吸取量定容编号种类大KNO319001019000量NH4NO316501016500

28、I元MgS04 7H2O3701037001000100素KH 2P04170101700CaC12 2H20440104400MnS04 4H2O22.31002230ZnS04 7H2O8.6100860II微H3BO36.2100620量KI0.831008310010元Na2M004 7H200.2510025素CuSO4.5H2O40.0251002.5COCL2.6H2O0.0251002.5铁Na2-EDTA37.31003730100010盐FeSO4.4H2O27.81002780甘氨酸2.050100III有盐酸叱哆醇0.55025机盐酸硫钱素0.150550010物烟酸0

29、.55025肌酸100505000注意：1.大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量 后，除CaCl2 2H2O单独配制外，其余化合物混合在 500ml烧杯中加适量蒸储水 溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入 1000ml容量瓶中用蒸储水定容至刻度，置小口 瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaC12 2H2O配制同上置于另一小口瓶中。2微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSC4 7H2O 和Na2-EDTA.2H2。）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少 量蒸馏水溶解后，定容在100

30、0m1 容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。3 .铁盐配制将FeSC4 7H2。和Na2-EDTA.2H2。分别溶于450ml蒸储水中，加热，不断搅拌，溶解后， 两液混合，调 PH 至 5.5加水定容至1000m1， 置于小口瓶中，贴上标签。4有机物母液配制，按母液要求浓缩50 倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml 容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5母液最好在24的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。6制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须

31、是高纯度的（分析纯）。7称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。四生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸 （ NAA） ，呷咪乙酸（IAA）,赤霉素（GA3）, 2, 4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量 95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（ KT）和6-苇基喋吟 （BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。称取 50mg 生长调节物质，溶解后，在100ml 的容量瓶中定容，配制的母液每毫升

32、则含有生长调节物质 0.5mg,配制后一般要求在低温（04C）保存，配制培 养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为 0.5mg时，则取1ml母液 即可。实习六营养培养基配制和灭菌一养培养基配制程序（一 ）.母液吸取量的计算配制培养基的升数公式1:母液吸取量=母液体积（CC）x母液浓缩倍数培养基要求的含量公式2：母液吸取量= （各种生长调节剂）母液每 CC 的含量（二） 各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2。；C.微量元素；D.铁盐； E.有机物；F.生长素蔡乙酸（NAA：配制0.5mg/ml的NAA取50mg , NAA用少量95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1

33、000ml； G. 细胞分裂素、激动素 （ KT） 配制 0.5mg/ml的KT称50mgKTB少量1N HCL溶解后，加蒸储水定容至100ml。（三 ） 配制培养基1. 琼脂 : 称取 57g 琼脂，加入300ml 蒸馏水， 加热溶解直至完全溶解为止.2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g 白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水中。3. 各种母液的吸取（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2 2H2O母液（B）各 100ml（2）分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C）,铁盐（D）母液各 10ml（ 3） 用 10ml 移液管或吸管吸取有机物（H） 10ml（ 4）

34、用 2ml 移液管吸取生长素NAA1.5ml ；用 0.5ml 移液管吸取KT0.5ml将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80左右，用酸度计或精密PH 试纸测定培养基的PH 一般要求5.86.0，过酸过碱则用1NNaoH 和 1N HCL 调整。二分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml 培养基分装70 支试管，即每支试管15ml 左右（一般占试管、三角瓶容量1/41/3 左右）注：培养基勿碰试管壁。三 . 包装：分装好的试管用棉塞塞上，包上包装纸，每57 支试管捆成一扎，标明培养基代号即可进行灭菌。用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管

35、、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。四灭菌：固体营养培养基灭菌通常都用热压法，液体培养基可用热法，也可用过滤法，现操作热压法灭菌。热压灭菌的锅具有温度范围115135，良好的灭菌取决于时间、压力、温度和被灭菌的容积，此法优点是：迅速、简便、全部微生物和病毒均能被破坏并无吸附现象。缺点：（ 1）会引起PH 改变：降低0.30.5个单位值；（ 2）某些化合物会分解或发生化学反应，在太高温度下热压处理会使糖焦化。这种产物可能有毒； （ 3）热压灭菌时间太长会使盐沉淀下来；（ 4）会使琼脂解聚；（ 5）导致某些有机的生理活性物质的活力下降。因此， 为达到良好的灭菌效果，而又尽量减少对营养成

36、分的不利影响要求。（ 1） 盛有 2050ml 营养培养基的容器就在121中保持20分钟；（ 2） 盛有 50500ml 营养培养基的容器就在121中保持25分钟；（ 3） 盛有 5005000ml 营养培养基的容器就在121中保持35分钟；具体操作步骤：1. 高压锅放水至平把架；2. 把包扎好的培养基装入高压锅;3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽 （注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀.4. 把热压锅放在3000W电炉座上，然后接通电源.5. 压力计升至0.5Kg 时，打开放气阀,排除冷空气（此步很重要）反复两次至完全把冷空气排除。6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到1Kg 位置时，开始计算灭

37、菌时间，一般在 1Kg 压力（121）下灭菌2025分钟即可，但要注意保持稳定压力。7. 灭菌时间达到20分钟后， 除去电源，打开放气阀（注意要逐渐放气）待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖（注意对角扭松螺帽）稍待冷后再把培养基取出。8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25下保存4 天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4低温下保存。灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。进水-放进培养基-盖紧锅盖-关上放汽阀-检查安全阀-接上加热源-待压力升至0.5Kg时排锅内

38、冷空气，重复两次，直至冷空气排除，关上放气阀-1Kg 压力（121C）下灭菌2025分钟，保持稳定压力-除热源-逐渐打开放气阀-锅 内空气排除完后-开放锅盖-稍冷后取出培养基。七 外植体（甘蔗尾稍幼叶）的分离、接种和培养实习（初代培养）植物组织培养的成功首先在于初代培养，即能否建全起于无菌外植体，注意几个重要环节。一保证无菌主要保证培养材料和培养基的无菌状态培养室的良好的清洁环境，以及工作人员的无菌操作技术，材料灭菌，不同作物，一株不同部位都有不同的要求，常用的消毒剂有漂白粉（1%10%的溶液） ，次氯酸钠液（0.510%）乌斯普龙溶液（8001500倍 ），升汞（HgCl 0.11%）酒精

39、70% ，双氧水（310%）等。材料灭菌的方法视不同作物，不同部位而异（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒，因暴露于空气中，有较多的茸毛、油脂、蜡质和刺等，首先用自来水较长时间冲洗，特别多年生木本材料更注意，有的可用肥皂、洗衣粉或吐温等进行洗涤酒精浸泡数秒钟-无菌水冲洗23次-按材料老、嫩用枝条的坚实程度，分别用2%10%次氯酸钠溶液浸泡1015分钟-无菌水冲洗 3次f接种。（2）果实及种子消毒，果实：自来水冲洗 1020分钟-纯酒精迅 速漂洗一下-2%次氯酸钠溶液浸泡10分钟-无菌水冲洗23次-取出果内种子 或组织进行培养。种子：自来水冲洗1020分钟-10%次氯酸钙浸泡2030分钟甚至几个小时，

40、依种皮硬而定，对难于消毒的还可用0.1%升汞或1%2%溴水消毒 5 分钟，进行胚或胚乳培养，对种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮再用48%次氯酸钠溶液浸泡810分钟-无菌水冲洗后-接种。（ 3）花药消毒用于培养的花药，实际上多未成熟，外有花萼，花瓣或颖片保护， 处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可，一般用70%酒精浸泡数秒钟-无菌水冲洗23次-漂白粉清液浸泡10分钟-无菌水冲洗23次f接 种。（ 4）根及地下部分器官的消毒，这类材料生长于土中，消毒较为困难，先用自来水洗涤，用软毛刷刷洗-用刀切去损伤及污染严重部位吸干后-纯酒精漂洗 - 0.1%0.2%升汞浸泡510分钟或2%次氯酸钠溶

41、液浸泡1015分钟无菌水冲 洗34次-无菌滤纸吸干后接种。若上述方法仍不见效时，可将材料浸入消毒 液中进行抽气减压帮助消毒液的渗入达到彻底灭菌的目的。二条件合适要成功地建立初代培养，首先一定要选择好合适的作物种类，品种及培养部位， 目前组织培养已经获得成功的植物，几乎包括植物的各个部位，在生产实际中，必须选取最易表达全能性的部位，增加成功机会，降低生产成本，大多数植物茎尖是较好的部位，由于其形态已基本建成，成长迅速、遗传性稳定，也是获得无病毒的主要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，为此茎段也得到了广泛的应用， 而叶片的培养利用更为普遍，材料来源最为丰富，一些培养较困难的植物则往往可以通过子叶

42、，下胚轴培养奏效。花药和花粉培养成为育种和得到无病毒苗的主要途径之一，其他可根据需要采用根，花瓣鳞茎等部位培养，总之，在确定取材部位时，一方面要考虑培养材料的来源有保证、容易成苗，另一方面要考虑到特别是通过脱分化产生愈伤组织培养途径是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状，取材亦受季节影响，器官的生理状态和生育年龄，材料大小的影响，茎尖培养存活临界大小应为一个茎尖分生组织带有12 叶原其，大小为0.20.3mm,叶片、花瓣等约为5mm2,茎段则长约0.5mm,甘蔗心叶愈伤组织中，5mm 左右； 第二，选择好合适的培养基激素及其他添加物；第三，注意掌握适宜的培养条件，如光照、温度、湿度。1光光因

43、素包括日照长度，辐射强度，光源（波长）（ 1）光照长度（光周期）对此问题了解得很少，常用的日长即选用 1416小时， 虽然也有连续光照的，不同培养物对日长要求有时很严格，如需暗萌发的种子要求在连续黑暗中才能萌发，需光萌发种子必须有光照。有的植物进行休眠或开花，必须选择特定的日长范围。（ 2）辐射强度培养瓶内的培养物不能采用像田间或人工气候室那么强的光照（3070Wm 2）通常用815Wm 的光照。（ 3）光源（波长）红光能促进生长和分化2温度培养室内常用温度2426，25± 2一般低于15培养的组织生长出现停滞，高于35的生长也不利，促进芽的温度略低于增殖苗的温度一般恒温。3 湿度：

44、 培养容器内的相对湿度几乎达到100%， 而环境中的温度会影响培养基湿度一般要求70%80%的相对湿度。4气体的影响：试管苗生长和繁殖需氧气，液体培养需进行振荡或浅层培养以解决供氧问题。三技术过关要建立初代培养，操作技术亦十分重要，无菌操作快，动作熟练，缩短可能污染的时间。甘蔗尾稍幼叶培养：一接种室的清洁和消毒，接种前半小时，可用75%酒精或新洁尔灭喷洒，地板用湿拖把拖刷。超净工作台在接种前用95%酒精揩抹工作台面和有关用具，并先开机鼓风15分钟后才能使用。二培养基甘蔗梢部幼叶培养基常用MS 和 N6 两种培养基根据实际情况适当调整。诱导培养基：MS+2 , 4-D0.53 Mg/L+3%蔗糖

45、+0.6%琼月旨(PH5.86.0)继代培养基与诱导相同。三外植体的选择、分离：1选择无病害的健壮甘蔗尾部2,用10%次氯酸钠溶液浸泡15分钟-无菌水冲洗3次3剥外边的老叶，每剥一层，用70%C2H5OH 擦一次4在无菌条件下，把最高可见肥厚带，这叶定为零叶，向内为负叶，向外为正叶， 一般以负13 叶为外植体，容易诱导出愈伤组织，其中的生长点以上510cm的节段为好。5将零叶以内的嫩叶梢用单面刀片或剪刀，解剖刀从蔗尾上剥离下来，剪成小段置于烧杯中。四外植体的灭菌在超净工作台上将0.1%HgCl2溶液倒入装有嫩叶鞘片段的烧杯内灭菌 10分钟, 用无菌水将嫩叶鞘冲洗三次。五 外植体的接种与培养用经

46、过灭菌的剪刀将嫩叶鞘剪成0.5cm2 大小的小块置于经过灭菌的培养皿中， 打开培养瓶盖子（或试管塞子）用经过灭菌的镊子将外植体置于培养容器内，让外植体与培养基紧密接触，然后盖上盖子并拧紧（或塞上塞子）写上接种日期和外植体名称即转入培养室内培养，室内温度2530，光强为10002000LUX,每天光照约14 小时。无菌操作：1 在准备室内改穿经过灭菌的白色工作服及拖鞋，戴上白布帽和口罩，才能进入无菌室。2 进入无菌室前工作人员双手须用肥皂洗净，进行操作前用75%C2H5OH 擦抹双手。3操作时，注意：（ 1） 若是试管，应在酒精灯火焰上封口，接种迅速避免烧伤材料，若是培养瓶，拧开盖子，迅速将材料

47、放入。（ 2） 每接一瓶，用具都应用95%酒精棉球擦并在火焰上烧灼，避免交叉污染。（ 3） 操作结束，整理，清洁干净用具。实习八具腋芽培养物的微繁殖通过组织培养诱导腋芽的增殖是植物快速繁殖的一个有效途径，本实习， 用甘蔗腋芽离体繁殖。一接种室的清洁和消毒(同前)二培养基：MS+NAA 0.55+KT 0.55+3%蔗糖+0.8%琼脂(PH5.86.0)三外植体取材，分离和灭菌：1从无病虫的优良甘蔗材料切取幼嫩茎段，用自来水冲洗干净。2在95%C2H5OH 浸泡1 分钟，再放入20%次氯酸钠溶液中浸泡1520分钟，用无菌水冲洗35 次。四接种在无菌条件下，把茎段切成一个节长约1cm 的带腋芽小段

48、接种入培养基上培养，放入培养室内，获无菌腋芽苗。实习九继代培养通过外植体进行初代培养，能否不断增殖并进行继代，既是植物组织培养能否成功实际应用的关键，又是植物离体快速繁殖中第二个阶段的目的，也是最为重要的一个问题。外植体的细胞经过启动，分裂和分化等一系列深刻变化过程，形成了无序结构的愈伤组织块，它们若在原培养基上继续培养，由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累会导致愈伤组织块停止生长，直至老化变黑死亡，因此， 若是要求愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如24 周）将它们分成小块接种到新鲜的培养基上（培养基配方同原培养基）继代培养，愈伤组织仍可保持旺盛生长，若每 810 天继代一次，还可获得胚性

49、愈伤组织细胞团，在切口处产生黄色或乳黄色的愈伤组织，表面呈颗粒状突起，30 天左右颗粒状突起出现大量球形、棒状的胚状体细胞团，同样，可以用分割方法进行反复继代培养。愈伤组织的质地有明显差异，有的很松脆，有的很坚实，两种愈伤组织可以互相转变；加入高浓度生长素可使坚实的愈伤组织变松脆，反之， 降低或除去生长素， 松脆愈伤组织可以转变为坚实型。松脆的愈伤组织有大量的分生组织中心能进行活跃的细胞分裂；坚实的愈伤组织很少分化，大都是高度液泡化的细胞，松脆的愈伤组织是进行悬浮培养的最适材料，稍经机械振荡，便可使组织分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团。愈伤组织长期继代培养往往容易引起其细胞的染色体变化

50、，如出现多倍体，非整倍体、染色体丢失、染色体断裂或重组，随继代培养次数和时间的增加，愈伤组织的此种变化频率也随之增加，这对保持供体植物的遗传性很不利，继代增殖的代数视不同作物不一样，一般能达到继代增殖210 倍， 即可用于大量繁殖，不要盲目追求过高增殖倍数，甘蔗不超过10 代， 香蕉芽不能超过12 代。 一个芽繁殖不能超过2.5倍。一继代培养方法继代培养可以固体和液体培养两种方法：1 固体培养：多数继代方法都用固体培养，将愈伤组织分割成小块或进行分株、分割、剪截（剪成单芽茎段）并转接于新鲜培养基上。2液体培养：以原球茎或胚状体方式增殖，可用液体培养进行继代培养，进行振荡培养（用旋转、振荡培养）

51、，保持22恒温，连续光照。二继代培养基大多数继代培养基与原诱导培养基相同（如：甘蔗、香蕉）但也有认为改变培养基的培养条件来保持继代培养，有的加活性炭，有的从 MS 培养基转入降低氨态N和钙，增加硝态N、Mg、P的培养基中，有的认为在继代培养基中用KT优于2IP,认为可使用较弱的细胞分裂素。三甘蔗愈伤组织，胚状体继代培养甘蔗嫩叶接种在合成培养基上一周后便逐渐形成愈伤组织，为保持愈伤组织的旺盛生长，一般约34 周将愈伤组织进行继代培养，继代培养控制在10 代左右方法：1在无菌条件下，用无菌的镊子（或接种针）从培养瓶中取出愈伤组织，将它们放在无菌的培养皿中。2 .用无菌解剖刀把每块愈伤组织分割成若干

52、小块（一般不小于5mm x 5mm）并把已坏死的区域弃去。3 用无菌镊子将小块愈伤组织放入新鲜的培养基上，每瓶 （或管培养基可以放 35 块，盖上盖子）（或塞上塞子）后置于培养室中继代培养甘蔗体细胞胚状体的发生，有2 种途径：一是直接由甘蔗嫩叶（或芽） 的愈伤组织产生，嫩蔗叶离体培养3050 天，可看到蔗叶边缘愈伤组织上长出松散的、黄白的颗粒的胚性细胞团，并可在原培养基上下经转移直接发育成小植株；二是通过愈伤组织挑选胚状体细胞团从中筛选胚性细胞无性系，在继代繁殖培养中产生大量的胚状体，前者产生胚状体频率低，后者产生胚状体的频率高。采用固体培养或液体培养培养基：MS+NAA i-4mg/L+KTi. 3mg/L+白糖 3%+琼脂 0.8%（液体不力口）PH5.86.0 都可育出胚性细胞无性系。经验证明：新“分离的愈伤组织往往具有较强的再生能力”但经过多次继代后， 形成器官的能力会逐渐降低，以至最后消失，甘蔗愈伤组织继代培养中和愈伤组织转到分化培养基中，都可获得生活力强的胚性细胞团，而以愈伤组织的继代增殖的数量大，因愈伤组织转化培养的过程中一面在分化绿苗，一面在