microRNA研究

1、microRNASmall molecular, Big worldmicroRNA的发现与研究历史的发现与研究历史microRNA2002年年science十大科学发现之首十大科学发现之首DNARNA蛋白质蛋白质基因组学基因组学RNA组学组学蛋白质组学蛋白质组学蛋白质编码基因数量蛋白质编码基因数量人：人： 30,000果蝇和线虫：果蝇和线虫：12,000-14,000酿酒酵母：酿酒酵母： 6,200假单孢菌：假单孢菌： 5,500人和鼠的蛋白质编码基因人和鼠的蛋白质编码基因99%是共同的。是共同的。人个体间单倍体基因组的碱基差异人个体间单倍体基因组的碱基差异300万个，其中万个，其中1万万个

2、（个（0.3%）出现在蛋白质编码基因中。）出现在蛋白质编码基因中。98%转录产物是非编码蛋白转录产物是非编码蛋白RNA。2倍倍2倍倍RNA的分类的分类 细胞核和胞液细胞核和胞液 线粒体线粒体 功能功能核蛋白体RNA rRNA mt rRNA 核蛋白体组成成分信使RNA mRNA mt mRNA 蛋白质合成模板转运RNA tRNA mt tRNA 转运氨基酸不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接、转运小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的 信号识别体的组成成分非编码非编码RNA (ncRNA)：不被翻译成蛋白质的不被翻

3、译成蛋白质的RNA，这些，这些RNA不被翻译成蛋白质，但是参与蛋白质翻译过程。不被翻译成蛋白质，但是参与蛋白质翻译过程。Noncoding RNAs (ncRNAs) in eukaryotesSmall RNA (sRNA) in bacteriaSmall nuclear RNAs (snRNAs)Small nucleolar RNAs (snoRNAs)MicroRNA(miRNA)Small temporal RNAs(stRNAs)Small interfering RNAs(siRNAs)RNA interference (RNAi)Guide RNAs(gRNAs)tRNA/m

4、RNA: tmRNA有些小有些小RNA分子能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的分子能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型生长发育并决定细胞分化的组织类型小小RNA分子本身又包含了若干类分子本身又包含了若干类RNA，根据小，根据小RNA 的生成、的生成、结构和功能大约可分为以下三类：结构和功能大约可分为以下三类：miRNA （microRNA)siRNA (small interfering RNA)其他小其他小RNAmicoRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，它们是

5、由家族，它们是由19-23个核苷酸组成的单链个核苷酸组成的单链RNA（3端端可有可有12个碱基长度的变化）个碱基长度的变化）表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的有不同类型的miRNA；在生物发育的不同阶段里有不同的；在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达表达与靶与靶mRNA 3-UTR结合，序列特异性的在转录后水平调控结合，序列特异性的在转录后水平调控基因的翻译表达基因的翻译表达 ，在生物发育、脂肪代谢、细胞的分化、增，在生物发育、脂肪代谢、细胞的分化、增殖和凋亡等过程中发挥着重要作用殖和凋亡等过程中发挥着重

6、要作用 miRNA具有高度保守性，即各种具有高度保守性，即各种miRNA都能在其他都能在其他种系中找到同源体；种系中找到同源体；miRNA独有的特征：其独有的特征：其5端第一个碱基对端第一个碱基对U有强烈的有强烈的倾向性，而对倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏乏C miRNA执行一定的生物学功能：执行一定的生物学功能：对与其互补的对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用；表达水平具有调节作用； 一些偏大的一些偏大的miRNA (27nt)可能参与了基因组

7、的重组装可能参与了基因组的重组装参与生物的发育与多种生理、病理过程参与生物的发育与多种生理、病理过程为什么为什么miRNAs非常重要非常重要 ?microRNAs 是一类新的基因调控因子是一类新的基因调控因子某些某些miRNAs控制了动植物的发育控制了动植物的发育 理解理解miRNA 的功能将有助于现在流行的的功能将有助于现在流行的siRNAmicroRNAs 有可能成为新型的疾病标志物有可能成为新型的疾病标志物microRNAs 可能具有重要临床应用价值可能具有重要临床应用价值实验结果：实验结果：RNA干扰基因沉默干扰基因沉默199320002001200220032004200520062

8、007microRNA的研究历史的研究历史Dr. Victor Ambros1993200020012002200320042005200620071993200020012002200320042005200620071993200020012002200320042005200620072001年年 命名为命名为microRNA1993200020012002200320042005200620072002年年 入选入选science年度十年度十大科学发现之首大科学发现之首199320002001200220032004200520062007The first demonstration

9、 of a link between miRNA genes and cancer.199320002001200220032004200520062007miRNA controls some plant phenotype199320002001200220032004200520062007The first quantitative real-time PCR developed for miRNA profiling, designed for the amplification of precursor molecules.19932000200120022003200420052

10、0062007The first study to report on miRNA profiling using an oligonucleotide microchip.The first paper to explore, by using genome-wide miRNA profiling by microarray,the potential importance of miRNAs in the diagnosis and prognosis of a human malignancy199320002001200220032004200520062007An elegant

11、study that shows a pathogenetic link between miRNAs and target oncogenes.199320002001200220032004200520062007The first paper to show that the deregulation of a single miRNA gene can lead to cancer.199320002001200220032004200520062007通过生物信息的手段分析了通过生物信息的手段分析了microRNA在蛋白相互作用网络和转录因子在蛋白相互作用网络和转录因子-microR

12、NA相互调控网络中的作用相互调控网络中的作用19932000200120022003200420052006200721-nt dsRNAs targeting selected promoter regions of human genes caused long-lastingand sequence-specific induction of targeted genes199320002001200220032004200520062007Nature 449, 682-688 (11 October 2007) |19932000200120022003200420052006200

13、7Sanger Release 10.0 contains 5071 hairpin precursor miRNAs, expressing 4922 mature miRNA products, in primates, rodents, birds, fish, worms , flies, plants and viruses in August 2007microRNAs had been neglected for so many years because of their small size. Whats new about miRNA research in recent

14、days?16001200No. of publications:5,209by 10/1/20081428130794082880048440016302636199320012002200320042005200620072008YearNo. of publications microRNA publications increased very rapidly 8186 papers/2010.07.197 By 2003: 145 genes/ 152 mature miRNAs (Sanger Release 3.0) By 2004: 192 genes/ 207 mature

15、miRNAs (Sanger Release 5.1) By 2005: 281 genes/ 319 mature miRNAs (Sanger Release 7.1) By 2006: 411 genes/ 455 mature miRNAs (Sanger Release 9.0) By 2007: 541 genes/ 733 mature miRNAs (Sanger Release 10.1) By 2008: 695 genes/ 866 mature miRNAs (Sanger Release 12.0) Total number of miRNA genes predic

16、ted:Whats new about miRNA research in recent days?1,000 (Landgraf et al. 2007, Tuschl Lab)25,000 (Miranda et al. 2006, IBM Bioinformatics Group)MicroRNA publications increased very rapidlyHow many miRNAs are there in human?8Whats new about miRNA research in recent days?MicroRNA publications increase

17、d very rapidlyHow many miRNAs are there in human?What regulates miRNAs ? (He et al. 2007; Diederichs & Harber 2007;Ruby et al. 2007; Viswanathan et al. 2008)New role of miRNAs as tumor suppressors (He et al. 2007; Mayr et al. 2007) and tumor invasion and metastasis (Ma et al. 2008)MicroRNAs regu

18、late stem cell self-renewal and differentiation (Wang et al. 2007; Park et al. 2007; Yu et al. 2007; Yi et al. 2008; Tay et al. 2008)MicroRNAs function in immune systems (Li et al. 2007; Rodriguez et al. 2007; Thai et al. 2007)Viral miRNAs regulate (HIV or HSV-1) replication (Triboulet et al. 2007;

19、Umbach et al. 2008)MicroRNAs can target 3-UTR, 5-UTR and coding regions (Lytle et al. 2007; Easow et al. 2007; Tay et al. 2008)microRNA的加工成熟与分布的加工成熟与分布据体内外实验研究表明据体内外实验研究表明miRNA的生成需要的生成需要两个步骤两个步骤：1)由长的内源性转录本（由长的内源性转录本（pri-miRNA)经经Drosha酶酶作用生成作用生成70nt左右左右的的miRNA前体前体(pre-miRNA)，该过程发生在细胞核，该过程发生在细胞核2)将将p

20、re-miRNA经经Dicer酶酶作用加工为成熟作用加工为成熟miRNA，该过程发生在细，该过程发生在细胞质中。胞质中。microRNA的加工成熟的加工成熟microRNA是动、植物自身基因组编码形成的一类小分子是动、植物自身基因组编码形成的一类小分子首先由基因组转录形成长链首先由基因组转录形成长链RNA分子分子pri-miRNA约约60%的的microRNA为独立转录表达；约为独立转录表达；约15%miRNA为成簇为成簇存在而共同转录；其余还有约存在而共同转录；其余还有约25%的的miRNA定位于功能基定位于功能基因内含子，随基因转录表达。因内含子，随基因转录表达。Pri-miRNA经双链经

21、双链RNA核酸酶核酸酶Drosha酶作用，加工形成酶作用，加工形成70-100nt长度的长度的pre-miRNAPre-miRNA在在Exportin5介导作用下转运出胞核至胞质中进行介导作用下转运出胞核至胞质中进行下一步加工下一步加工Pre-miRNA在胞质中经双链在胞质中经双链RNA核酸酶核酸酶Dicer酶作用加工形成酶作用加工形成单链成熟单链成熟miRNA分子分子Overall, 98 of 186 (52.5%) of miR genes are in cancer-associated genomic regions or in fragile sitesmicroRNA的分布的分布

22、microRNA的作用机制的作用机制miRNA发挥作用过程发挥作用过程19-23nt的成熟的成熟miRNA形成后与其他蛋白共同组成形成后与其他蛋白共同组成RNA介介导的沉默复合体（导的沉默复合体（RISC）参与）参与RNA干扰途径干扰途径miRNA形成形成RISC复合体后可与特定的靶复合体后可与特定的靶mRNA结合，这种结合，这种结合不要求严格的互补配对。结合后导致靶结合不要求严格的互补配对。结合后导致靶mRNA翻译的抑制翻译的抑制翻译抑制翻译抑制5end of the small RNA,28, known as the “seed region”do not have a complex

23、secondary structure and are located in accessible regions of the RNAmicroRNA识别靶位点识别靶位点microRNA作用机制作用机制miRNA与与siRNA的联系：的联系：均为均为Dicer的产物的产物长度均为长度均为22nt左右，左右，5端是磷酸基，端是磷酸基，3端是羟基端是羟基均需均需Argonaute家族蛋白的存在家族蛋白的存在同为同为RISC的组分的组分二者进化关系上可能的两种推论：二者进化关系上可能的两种推论：siRNA是是miRNA的补充的补充 miRNA在进化过程中替代了在进化过程中替代了siRNA沉默机制有

24、重叠沉默机制有重叠miRNA的加工成熟过程与的加工成熟过程与RNAi技术中常用的技术中常用的siRNA有许多有许多相似之处相似之处均经过均经过Dicer酶酶对对双链双链RNA的识别加工而形成的识别加工而形成单单链链RNA分子分子。miRNAsiRNA产生细胞内RNA的固有组分之一（正常）RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生（异常）来源内源转录本转基因或病毒RNA（外源）直接来源发夹状pre-miRNA长dsRNA结构单链双链，3端有2个非配对碱基，通常为UU互补性不完全互补，存在错配现象完全互补对靶RNA特异性相对较低，一个突变不影响miRNA的效应较高，一个突变即引

25、起RNAi沉默效应的改变途径miRNA途径RNAi途径对RNA的影响在RNA代谢的各个层面进行调控降解靶mRNA功能调节内源基因的表达，在蛋白质合成水平发挥作用，与mRNA的稳定性无关抑制转座子活性和病毒感染，在转录后水平发挥作用,影响mRNA的稳定性miRNA与与siRNA的区别的区别microRNA与肿瘤与肿瘤 Oncology Bladder Breast Cervical Colon Leukemia Lung Pancreas Prostate Thyroid Brain Alzheimers Multiple Sclerosis Prion Disease Stroke Misce

26、llaneous Atherosclerosis Cardiac Hypertrophy Diabetes HIV/HPV Infection Lupus Cellular Process Angiogenesis Apoptosis Cell Cycle Neuronal Differentiation Proliferation Telomerase Activity T-cell Activation Various Cell TreatmentmiRNA Disease AnalysismicroRNA与肿瘤E2F1E2F1 Tsp1 CTGFmiR-1792簇簇miR-1792簇位于

27、簇位于13q31，其中包含了，其中包含了7个个microRNA: miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-20, miR-19b-1 和和miR-92-1 ODonnell等发现等发现MYC可以结合到可以结合到miR-17-92簇所在基因簇所在基因C13orf25的第一个内含子上，并诱导的第一个内含子上，并诱导miR-17-92簇的表达簇的表达 与与p53相关的相关的miRNA 2007-06-06肿瘤有着独特的肿瘤有着独特的miRNA表达谱表达谱microRNA相关研究相关研究microRNA Expression AnalysismicroRNA Functional AnalysismiRNA Expression AnalysisStrategy OverviewSample preparationRNA isolationcDNA synthesisReal-time PCR analysis microRNA cDNA synthesis stem-loop RT poly(A) tail RT Real-time PCR workflow microRNA real-time PCR SYBR Green Taqman probemiRNA Func