第十二章DNA合成

1、核酸的生物合成 本章重点介绍遗传中心法则和本章重点介绍遗传中心法则和DNA、RNA的生物合成，对基因工程作一般介的生物合成，对基因工程作一般介绍。绍。 思考思考 DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年年Watson & Crick提出提出DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型后，后，1958年，年，Crick提出了提出了“(F)中心法则中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。揭示了遗传信息的传递规律。遗传信息传递的遗传信息传递的 中心法则中心法则蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA生物的

2、遗传信息以密码的形式储生物的遗传信息以密码的形式储存在存在DNA分子上，表现为特定的核苷分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过通过DNA复制复制把亲代细胞所含的遗传把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过传信息通过转录转录传递给传递给RNA，再由，再由RNA通过通过翻译翻译转变成相应的蛋白质多转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代执行各种各样的生物

3、学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的病毒能以自己的RNA为模板为模板复制复制出新出新的病毒的病毒RNA，还有一些，还有一些RNA病毒能以病毒能以其其RNA为模板合成为模板合成DNA，称为，称为逆转录逆转录这是中心法则的补充。这是中心法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面们对细胞的生长、发育、遗

4、传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。目目 录录第四节第四节 基因工程及分子生物学技术简介基因工程及分子生物学技术简介第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成第二节第二节 DNA重组重组第三节第三节 核酸合成的抑制剂核酸合成的抑制剂第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成一、DNA的复制的复制（DNA指导下的指导下的DNA合成合成）三、DNA突变突变四、 DNA的损伤与修复的损伤与修复二、逆转录作用逆转录作用（RNA指导下的指导下的DNA的合成）

5、的合成）一、一、DNA的半保留复制的半保留复制1、概念概念和和实验依据实验依据 DNA合成的通式及方向合成的通式及方向 2、原核生物原核生物DNA聚合反应有关的酶类聚合反应有关的酶类 3、原核细胞原核细胞DNA的复制的起始点和方式的复制的起始点和方式5、DNA复制的忠实性复制的忠实性6、真核细胞真核细胞DNA的复制的复制 4、原核细胞原核细胞DNA的复制过程的复制过程 F半不连续复制半不连续复制)DNA的半保留复制的的半保留复制的概念概念 DNA在复制时，两在复制时，两条链解开分别作为模板，条链解开分别作为模板，在在DNA聚合酶的催化下按聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条碱基互补的原则合成

6、两条与模板链互补的新链，以与模板链互补的新链，以组成新的组成新的DNA分子。这样分子。这样新形成的两个新形成的两个DNA分子与分子与亲代亲代DNA分子的碱基顺序分子的碱基顺序完全一样。由于子代完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复种复制方式称为半保留复制制。（1）DNA聚合酶聚合酶(DNA polymetases)（2 2）引物酶引物酶(peimase(peimase) )和和引发体引发体(primosome(primosome) ) ：启动：启动RNARNA引物链引物链的合成的合成。 (3(3）

7、DNADNA连接酶连接酶（DNA ligaseDNA ligase）（4 4）DNADNA解链酶解链酶(DNA helicase(DNA helicase) ) (5 (5）单链结合蛋白单链结合蛋白(single-(single-strand binding protein,strand binding protein,SSBSSB) )：结合在解开的结合在解开的DNADNA单链上，防止重单链上，防止重新形成双螺旋。新形成双螺旋。 (6(6）拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase(topoisomerase):):兼具内切酶和兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将连接酶活力，能迅速将DNA

8、DNA超螺旋超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。便于解链。解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物酶和引物酶和引发体引发体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 3 5 5 RNA引物引物 DNA复制过程是一个高度精确的过程，复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌据估计，大肠杆菌DNA复制复制109-1010碱基对碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点要有以下三点:a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱基配对原则）碱基配对原则）b、DN

9、A聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能（错配碱基被（错配碱基被3-5 外切酶切除）外切酶切除）c、起始时以、起始时以RNA作为引物作为引物DNA的半保留复制实验依据 19581958年年Meselson Meselson & stahl& stahl用同位素用同位素示踪标记加密度示踪标记加密度梯度离心技术梯度离心技术实实验验, ,证明了证明了DNADNA是是采取半保留的方采取半保留的方式进行复制式进行复制.15N DNA14N- 15N DNA14N DNA14N- 15N DNADNA合成的通式及方向合成的通式及方向 DNA合成是以4种dNTP(N=A, T, G, C)为底物，

10、在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3-OH添加脱氧核苷酸使链延长的过程。连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶ATP或或NADPPi或或NMNATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链模板链模板链大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB

11、大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型DNA复制的方式复制的方式环状环状 DNA复制复制时所形成的时所形成的Q结结构构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5 RNA引物引物3 3

12、 大肠杆菌有三大肠杆菌有三种种DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用聚合速度聚合速度(核苷酸核苷酸/分分)持续合成能力持续合成能力主要功能主要功能Pol Pol Pol 109,000400+1000-12003-200DNA修复修复RNA引物切除引物切除120,000100+-24001500DNA修复修复400,00010-20+15000-60000500000DNA复制复制比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA

13、polymerase I大片段(Klenow fragment)小片段5 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用DNA聚合酶聚合酶全酶全酶 核心酶Pol IIIPol III延长因子DNADNA聚合酶聚合酶二聚体二聚体primase A primosome is a complex of seven proteins: DnaG primase, DnaB helicase, DnaC helicase assistant, DnaT, PriA, Pri B, and PriC. DNA Ligase ligase from m

14、any bacteria/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb55_1.html1. 不能催化单链DNA连接2. 必须具有粘性末端双链DNA，而不是平齐末端3. 羟基和磷酸基团必须相邻DNA helicaseIf I were an enzyme, I would be DNA helicase ,so I could unzip your genesSingle-stranded DNA binding proteinfrom M. tuberculosis, M. l

15、eprae and M. megmatis SSBtopoisomerasecuts one strand of a DNA double helix and then reanneals the cut strand. cuts both strands of one DNA double helix, passes another unbroken DNA strand through it, and then reanneals the cut strand Type IType IIDNA聚合酶催化的链延长反应3 5 模板链5 RNA引物引物子链3 35533553大肠杆菌三种大肠杆菌

16、三种DNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用转化率转化率DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶（复合物）（复合物）109，000400+1120，000100+-0 .05400，00010-20+50比较项目比较项目DNADNA聚合酶的聚合酶的3 3 - 5- 5 外切酶水解位点外切酶水解位点3 3 5 5 错配碱基错配碱基3 - 5 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型复制叉处前导链和随后链同

17、时合成的工作模型聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物引物体引物体引物体引物体解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能5 5 - -核酸核酸外切酶外切酶3 3 - -核酸核酸外切酶外切酶裂缝裂缝聚合中心聚合中心裂缝内部裂缝内部DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正正 确确核苷酸核苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点 端粒（端粒（teleme

18、retelemere）复制）复制端粒酶（端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于种逆转录酶，它能催化互补于RNA模

19、板的模板的DNA片段的合片段的合成，使复制以后的线形成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识会有助于对生命衰老的认识。5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型

20、3 5 TTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3 5 AATTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5 3 nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTCCCCT nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTAAAAC

21、CCC AAAACCCC AAAACCCCT n进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸真核和原核真核和原核DNA细胞复制比较细胞复制比较1 1、概念、概念2、逆转录酶、逆转录酶3、病毒逆转录过程病毒逆转录过程4 4、逆转录的生物学意义逆转录的生物学意义扩充了中心法则扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶逆转录酶是分子生物学重要工具酶三种功能三种功能依赖依赖DNA指导下的指导下的DNA聚合酶活力聚合酶活力依赖依赖RNA的的DNA聚合酶活力聚合酶活力核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力 以以R

22、NARNA为模板合成为模板合成DNADNA，这，这与通常转录过程中遗传信息与通常转录过程中遗传信息从从DNADNA到到RNARNA的方向相反，故的方向相反，故称为逆转录作用。称为逆转录作用。逆转录过程中逆转录过程中cDNA的合成的合成依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸核糖核酸酶酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶逆逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期生活周期RNA衣壳衣壳被膜被膜逆转逆转录酶录酶转录转录转译转译整合入宿主细胞染色体整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞进入细胞丢失被膜丢失被膜丢失衣壳丢失衣壳逆转录逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋衣壳蛋白白被膜蛋被膜蛋白白逆

23、转录逆转录酶酶 DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为特性，称为DNA的突变。它包括由于的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。分子之间的交换而引起的遗传重组。二、二、诱变剂的作用诱变剂的作用 碱基类似物碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂碱基修饰剂(base modifi

24、er) 嵌入染料嵌入染料(intercalation dye) 紫外线紫外线(ultraviolet)和电离辐射和电离辐射(ionizing radiation)一、一、突变的类型突变的类型 碱基对的置换碱基对的置换(substitution) 移码突变移码突变(framesshift mutation) -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-转换转换 -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入插入A -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-

25、T-G-C-缺失缺失T野生型基因野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(framesshift mutation) 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于用于DNA，造成，造成DNA结构和功能的破坏，称为结构和

26、功能的破坏，称为DNA的损的损伤伤. DNA的修复主要有以下类型的修复主要有以下类型:暗修复暗修复（4）诱导修复（诱导修复（SOS修复）修复）（1）光裂合酶修复活光裂合酶修复活（2）切除修复切除修复 F（3）重组修复重组修复 DNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于、光复合酶结合于损伤部位损伤部位3、酶被可见光激活、酶被可见光激活4、修复后酶被释放、修复后酶被释放DNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复A形成嘧啶二聚体形成嘧啶二聚体B光复合酶结合光复合酶结合于损伤部位于损伤部位C修复后酶被释放修复后酶被释放DNA的

27、损伤和切除修复的损伤和切除修复碱基丢失碱基丢失碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配结构缺陷结构缺陷切开切开 核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切除切除DNA聚合酶聚合酶DNA连接连接酶酶AP核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切开切开切除切除修复修复连接连接糖苷酶糖苷酶插入酶插入酶碱基碱基取代取代DNA的重组修复的重组修复胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体二聚体复制复制核酸酶及核酸酶及重组蛋白重组蛋白修复复制修复复制DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶重组重组SOS反应的机制反应的机制靶基因表达靶基因表达lexA靶基因表达靶基因表达 但产物被分解但产物被分解recA大量表达大量表达RecA促使促使分解分

28、解LexA未诱导的细胞未诱导的细胞诱导的细胞诱导的细胞靶基因靶基因lexA基因被基因被LexA 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏recA基因被基因被LexA 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）个不同的位点被阻遏）LexA(阻遏物阻遏物) RecA(辅蛋白酶辅蛋白酶)单链单链DNAATP第二节第二节 DNA重组重组 DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组，DNA的重组广泛存在与各类生物，真核生物在减数分裂过程中两条同源染色体之 间的交换，在噬菌体的整合过程中，在转座过程中都发生DNA的重组。DNA重组在生物进化中起着重要作用。同源重组位点专一性重组转座重组同源重

29、组homologous recombination 指由两条具有同源性指由两条具有同源性的的DNA分子，通过错配，分子，通过错配，链的断裂和再连接，产生链的断裂和再连接，产生片段交换的过程。真核生片段交换的过程。真核生物染色体的交换，细菌及物染色体的交换，细菌及某些低等生物的转化，以某些低等生物的转化，以及重组修复都属于这一类。及重组修复都属于这一类。位点专一性重组位点专一性重组site specific recombination 噬菌体基因组插入到细菌基因组染色体上的方式噬菌体基因组插入到细菌基因组染色体上的方式就是位点专一性重组，这个过程也叫整合。这种重组就是位点专一性重组，这个过程也叫

30、整合。这种重组方式需要噬菌体方式需要噬菌体DNA和细菌和细菌DNA上的专一性位点，催上的专一性位点，催化这个重要过程的酶只能作用于这对专一性位点。化这个重要过程的酶只能作用于这对专一性位点。转座重组 transpositional recombination 转座重组指转座重组指DNA上的核苷酸序列在不同染色体之间或同上的核苷酸序列在不同染色体之间或同一染色体的不同区段之间移动，这些可以移动的一染色体的不同区段之间移动，这些可以移动的DNA片段就片段就是转座子。转座子最早在玉米中发现，目前在所有的生物中是转座子。转座子最早在玉米中发现，目前在所有的生物中都发现了转座子。都发现了转座子。1. C

31、onservative Transposition2. Replicative Transposition3. Retrotransposition 第三节第三节 核酸合成的抑制剂核酸合成的抑制剂 核苷酸合成抑制剂核苷酸合成抑制剂氨基酸类似物氨基酸类似物 叶酸类似物叶酸类似物 碱基和核苷酸类似物碱基和核苷酸类似物嵌合剂嵌合剂 烷化剂烷化剂 与与DNA模板结合的抑制剂模板结合的抑制剂 作用于作用于DNA聚合酶或聚合酶或RNA集合酶的抑制剂集合酶的抑制剂抗菌素抗菌素:如利福平、曲张霉素如利福平、曲张霉素有机化合物：如磷羧基乙酸有机化合物：如磷羧基乙酸第四节第四节 基因工程及分子生物学基因工程及分子

32、生物学 技术简介技术简介一、一、基因工程基因工程二、二、体细胞克隆技术体细胞克隆技术三、三、聚合酶键式反应聚合酶键式反应（polymerase chain reaction, PCR）一、基因工程简介一、基因工程简介 基因工程亦称遗传工程，即利用基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组重组技术的方法，把技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重新组合连接（重组重组），最后将重组体转入宿主细胞，使），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。原有的遗传性状。 基因工程的操作技术基因工程的操作技术 基因工程的应用与前景基因工程的应用与前景基因工程的基因工程的操作技术操作技术Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA moleculeIntroduction into host cells by trans