LAMP试验简介

1、通过 LAMP 实现 DNA 的线性扩增、LAMP 原理60-65C双链 DNA 复性及延伸的中间温度，DNA 在 65c 左右处于动态平衡状态。因此，DNA 在此温度下合成是可能的。利用 4 种特异引物依靠一种高活性链置换 DNA 聚合酶。使得链置换 DNA 合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。第 1 阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物 FIP 的 F2 序列首先与模板F2c 结合，在链置换型 DNA 聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3 与模板 F3c 结合并延伸，置换出完整的 FIP 连接的互

2、补单链。FIP 上的 F1c 与此单链上的 Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物 BIP 与 B3 先后启动类似于 FIP 和 F3 的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3末端的 Fl 区段为起点。以自身为模板，进行 DNA 合成延伸形成茎环状结构。该结构是 LAMP 基因扩增循环的起始结构。第 2 阶段是扩增循环阶段。 以茎环状结构为模板， FIP 与茎环的 F2c 区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以 3末端的 B1 区段为起点，以自身为模板。进行 DNA 合成延伸及链置换.形成长短不一的 2 条新茎环状结构的 DNA,BIP 引

3、物上的 B2 与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA 长度增加一倍。 在反应体系中添加 2 条环状引物 LF 和 LB,它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度 DNA 的混合物。且产物 DNA 为扩增靶序列的交替反向重复序列。A.ILRtaTHnnmRtRrtdiImnriiininnstsnIILEloratorandr9cydinste)屿、实验流程、阶段实验及需要解决的问题（一）实验准备阶段1、引物设计2、模板中引入合适的酶切位点3、不同梯度拷贝数模板的准备4、反应仪器的准备5、具有链置换活性的 DNA 聚合酶的选择6、扩增产

4、物的检测方法7、扩增产物量的检测（二）实验阶段1、反应体系的确定2、模板浓度的优化3、反应时间的优化4、扩增产物的检测5、以 PCR 的扩增作为对照、具体实验方案（一）引物的设计LAMP 引物设计的在线网站（http:/primerexplorer.jp/eZ）,只要导入靶基因就能自动生成成组引物。1、LAMP 引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因 3,端的 F3c、F2c 和 Flc 区以及 5端的 Bl、B2 和 B3 区等 6 个不同的位点设计 4 种引物。2、引物设计要点设计合适的引物是进行 LAMP 反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm 值等

5、。在进行 LAMEP 引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑：引物之间的距离F2 区段的 5端到 B2 区段的 5端（LAMP 反应扩增的区域）之间的距离建议是 120180bp。F3 区段的 3端到 F2 区段的 5端之间的距离是 020bp（同理 B2 和 B3 之间的距离是 020bp）。F2 区段的 5端到 F1 区段的 5f 端（形成环的部分）之间的距离是 4060bp。引物的 Tm 值一般情况下，根据引物与模板结合的先后顺序，其 Tm 值表现为：F1c、B1cF2、B2,这样链置换后形成的单链会易于结合成 loopF2、B2F3、B3,确保内引物会先于外引物结合到模板上进行扩增3、

6、引物设计结果HP-F:CGCGAGGTACCG.GCTCGTAAAACGA 侬顾砌 GTF:M13-47.HP-RGGCCTGCATGCAAGCTTGCAGCTATGACCATGATTACGCM13-48.M13-47100.0MM13Forward(-iO)1收EMRI4Q1CGCCAGGGTT4Q1CGCCAGGGTTTTCCCAGTCATTCCCAGTCACGACGHGTACGACGHGTAJULACGACGGCCAGTGAIITCJULACGACGGCCAGTGAIITCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGAGC

7、ATCTAGATATCGGAGCGGTGCGGT：CCAkAASGGTAGTGCT2CAACCAkAASGGTAGTGCT2CAAH H：.二一工.二二二二奈二二二二奈二二二二二二一九工人CGTAGATCTATAGCCTCGTAGATCTATAGCCTP州Hindlll501501ACTGCAGAGGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTT6GCGTCCTGCATGCAAGCTT6GCGTAATCATGGTCAATCATGGTCMAGCTETMAGCTETCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTACACA

8、CACTGACGKTTGACGKT二二二二匚藁.二二支二二二二二二L L二二二二AAAGGACACACTTTAACAATA&SCGAGTGTTAAAAAGGACACACTTTAACAATA&SCGAGTGTTAA期GTGGTG”箍说，3UII/I（二）引入合适的酶切位点方便扩增产物酶切后长度单一化。（三）聚合酶和反应温度的选择用 Bst 聚合酶在 60、63 和 65 三个梯度温度下进行扩增，用 Phi29 聚合酶在 37 进行扩增，在其他因素相同的条件下，比较两种酶的扩增效率，选取最优的聚合酶以及该聚合酶最佳的反应温度。（四）最佳反应时间的选择同样的条件下设置几个平行反应，分

9、别在 15min、30min、45min、60min、75min后通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。(五)延伸反应1、反应体系(1)反应体系的配制(25ul)FIP0.8uMBIP0.8uMF30.1uMB30.1uMEachdNTP400uMbetain1MTris-HCL20mmKCL10mm(NH4)2SO410mmMgSO44mmTritonX-1000.1%TargetDNA(2)变性退火将上述反应体系(除酶外)在 95c 力口热 5min 后，冷去|3,再力口入 8UPhi29DNA 聚合酶(3)等温延伸参 63c 保温延伸一定时间(4)终止反应在高于 80c 的

10、温度下加温 2min,终止反应。(六)PCR表 1PCRMix 配制加入量10PCRbuffer5uldNTP1ulM13-47(10um)1ulM13-48(10um)1ul模板 230bp0.5ulTaqPolymerase0.5ulH2O111ulTotal50ul（七）通过观察白色沉淀的量来检测 LAMP 扩增产物LAMP 反应阶段，随着反应的进行，dNTP 会释放出焦磷酸根离子，焦磷酸根离子遇到 Mg2+会生成焦磷酸镁白色沉淀，一般情况下，生成的白色沉淀与反应液中双链 DNA 的量是成正比的，因此可以通过浊度仪检测白色沉淀的量来定性反应的进行程度。只有当反应体系中 dNTP 的量达到

11、0.5M 时才有可能肉眼观测到沉淀。另外，PCR 过程中不断的 95c 热变性也阻碍了焦磷酸镁这一白色沉淀的生成。（八）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，SYBRGreenI 染色扩增结束后，其最后的产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜结构的 DNAt 段混合物，电泳后在凝胶上显示不同大小区带的阶梯式图谱。四、LAMP 优点1、快速、高效因为不需要预先的双链 DNA 的热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。 核酸扩增在 1h 内均可完成， 添加环状引物后时间还可以节省 1/2 左右， 在 20-30min内就可检测到扩增产物，1h 内可扩增出 109个靶序列拷贝，且产物可以达到 0.5mg/ml.2、高灵敏度对某些病毒的扩增，模板可达几个拷贝数即可，比 PCR 高出几个数量级。3、高特异性因为是针对靶序列的 6 个区域设计的 4 种特异性引物，6 个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增。4、产物检测方便LAMP 在合成 DNA 的同时会产生大量的焦磷酸跟离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，因此可以根据反应体系中是否生成白色沉淀来判断反应的进行情况。5、操作简单LAMP 反应只需要一个简单的恒温器，水浴锅、金属浴均可完成此操作