REAL-TIME引物设计与是否跨内含子的检测方法

1、REAL-TIME 引物设计与是否跨内含子的检测方法1 .丁香园子里最详细的检测引物是否跨内含子的流程2 .提供多图显示如何找到基因外显子与内含子3 .如何最简便设计跨内含子的引物（利用 primer-blast）感谢隔壁的山西人提出这个问题，以及丁香园，google,百度，PUBMED 提供解决问题的方法和线索供我拼凑整理。问题一：如何在 pubmed 上找到目标基因的 DNA 序列以及其内含子和外显子情况。步骤：打开 NCBI 主页面，选 GENE,输入基因名称-显示出很多不同种但名字相同的基因（fig.1）-找到你要的种属，打开-显示基因信息，找到Genomicregions,trans

2、cripts,andproducts”点击基因名称，links 到 geneback（fig.2）-显示了该基因 DNA 的信息（fig.3）,可以看到这是基因组 DNA,从 mRNA 选项中可以看到 JION 后面的是外显子的位置，该基因一个共有 3 个内含子，4 个外显子，以及外显子的起至位置，为了以后的操作，可以把这个 DNA 序列和外显子的起至位置记下来。Fig.1GEMIANKGRAPHICSMULinksvpd不/d如uhm01学G4num*crripofi,triHxcrvrts,andpunftuclxt?巾用%RM11O*H工OwwiMpH4*|nRwTXqftMmUOELC

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5、 blast 要用）并点开-显示这个基因的 mRNA 信息（Fig.5）,最后的 ORIGIN 是 CDNA 序歹 U,把它记下来，一会 PRIMER 的时候要用。Fig.4Fig.3gtntkRNAORIGIN/organist-rfRattusnorvegicua/MOItype-MgenoaicDKA”1.ri,-.FFKETF/db_xre-,HtaMon:10116”/chrcnoscut-2。”1.11193/gmwmL/note-H,Derivedbyaucotabtdc(MputdUdualdndlyaisusinggeneprtdlctionnethod;EatRefaeqr

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13、何设计跨内含子的引物（利用 primer-blast）1）打开 primer-blast 网站（/tools/primer-blast/）2）将 mRNA 编号（NM*）输入序列框中，realtimePCR 一般产物长度为 80150bp 也可以超一点，但是会影响扩增效率，这样就不能用 ddCT 法计算了，酌情考虑。温度在 5563 和 GC 含量在 40%60%,两条链不要差太远。点击 GETprimer详细的设计方法可以参看 http:/ GC 含量之类的再进行选择4）将初步选择的引物用 PRIMER5 验证引物二聚体，发卡结构等，方法见

14、下个问题问题四：用 PRIMER5查找已知引物的产物位置”弓 I 物设计原贝1J 见：http:/ 厝 F/rrn1rtinrtgullti$ft21(5,Ctrtvifi4)(Sird,mRNA-c(Rc 工 4)inputTtfnpliiTtino 班 k rrqetfwtrtfdundI 力 ftlKttdd 以bai：*:；NCfiiTF*fifrlpififtrtACSitquienctf(WrrWWATMFMBRJn1Enw-wSMSH，J*HCTATCCflT!W1T#a*HPiIrtiaipjIfIHMK-IIIMZi如trWb0W+urcSNmCfcpTm0444TMn-1V

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