第10章分子生物学课件学习教案

1、会计学1第第10章分子生物学课件章分子生物学课件第一页，共53页。第1页/共53页第二页，共53页。核酸分子核酸分子(fnz)杂交杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子单链分子(fnz)放在同一溶液中，或把放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一起放在一起，只要在，只要在DNA或或RNA的单链分子的单链分子(fnz)之间有一定之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子的碱基配对关系，就可以在不同的分子(fnz)之间形之间形成杂化双链成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹一、

2、分子杂交与印迹(yn j)(yn j)技术的原理技术的原理第2页/共53页第三页，共53页。复性复性(f xn)RNADNA第3页/共53页第四页，共53页。（一）印迹技术（一）印迹技术(jsh)(jsh)（二）探针技术（二）探针技术(jsh)(jsh) 探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在核苷酸，与固定在NC膜上膜上的核苷酸结合，判断是否的核苷酸结合，判断是否(sh fu)有同源的核酸分子有同源的核酸分子存在。存在。 第4页/共53页第五页，共53页。二、

3、印迹二、印迹(yn j)技术的类别及应用技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组、重组(zhn z)质粒和噬菌体质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(jsh) (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研用于蛋白质定性定量及相互作用研究。究。 第5页/共53页第六页，共53页。 其他其他(qt)(qt)斑点印迹斑点印迹 (dot b

4、lotting) (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ (in situ hybridization)hybridization)DNADNA点阵点阵 (DNA array) (DNA array) DNADNA芯片技术芯片技术 (DNA chip) (DNA chip)第6页/共53页第七页，共53页。三种三种(sn zhn)印迹技术的比较印迹技术的比较第7页/共53页第八页，共53页。分子杂交实验分子杂交实验目目 录录第8页/共53页第九页，共53页。放放射射(fngsh)自自显显影影照照片片目目 录录第9页/共53页第十页，共53页。DNA点阵点阵(din z

5、hn)目目 录录第10页/共53页第十一页，共53页。第11页/共53页第十二页，共53页。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作一、基本工作(gngzu)(gngzu)原理原理目目 录录第12页/共53页第十三页，共53页。Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含的含量可以扩大量可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录第13页/共53页第十四页，共53页。第14页/共53页第十五页，

6、共53页。n模板模板(mbn)DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、二、PCRPCR体系基本组成体系基本组成(z chn)(z chn)成分成分第15页/共53页第十六页，共53页。三、三、PCRPCR的基本反应的基本反应(fnyng)(fnyng)步骤步骤变性变性(binxng)95C延伸延伸(ynshn)72C退火退火Tm-5C第16页/共53页第十七页，共53页。（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列序列(xli)测定测定（五

7、）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途第17页/共53页第十八页，共53页。第18页/共53页第十九页，共53页。实时实时(sh sh)PCR(sh sh)PCR技术原理技术原理目目 录录第19页/共53页第二十页，共53页。第20页/共53页第二十一页，共53页。核酸序列核酸序列(xli)分析的基本原理分析的基本原理化学化学(huxu)裂解法裂解法 (Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成链的末端合成(hchng)终止法终止法 (sanger法法)第21页/共53页第二十二页，共53页。一、化学一、化学(huxu)(huxu)裂解法裂解法(Maxam

8、-(Maxam-GillbertGillbert法法) )基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个碱基个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制处发生专一性断裂的特性，精确地控制(kngzh)(kngzh)反应强度反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNADNA片段，将这片段，将这些片段经电泳分离。些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5末端，经放射自末端，经放

9、射自显影即可在显影即可在X X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。第22页/共53页第二十三页，共53页。二、二、DNA链末端链末端(m dun)合成合成终止法终止法第23页/共53页第二十四页，共53页。目目 录录第24页/共53页第二十五页，共53页。三、三、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四

10、种激光泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小激发不同大小(dxio)DNA片段上的荧光分子使之发片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 第25页/共53页第二十六页，共53页。DNA自动测序结果(ji gu)举例目目 录录第26页/共53页第二十七页，共53页。第第 四四 节节第27页/共53页第二十八页，共53页。 基因组基因组DNADNA文库文库(wnk) (genomic DNA (wnk) (genomic DNA library)libra

11、ry) cDNAcDNA文库文库(wnk) (cDNA library) (wnk) (cDNA library) 基因文库基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部(qunb)DNA(qunb)DNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。第28页/共53页第二十九页，共53页。基因组基因组DNADNA文库文库(wnk)(wnk)目目 录录第29页/共53页第三十页，共53页。第一轮筛选(shixun)第二轮筛选(shixun)第三轮筛选(shixun)基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例第30页/共53页第三十一页，共53页。第第 五五

12、节节第31页/共53页第三十二页，共53页。克隆疾病相关基因克隆疾病相关基因(jyn)的策略的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆(k ln)(functional (k ln)(functional cloning)cloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(k ln)(positional (k ln)(positional cloning)cloning)（三）非定位候选基因克隆（三）非定位候选基因克隆(k ln)(k ln)策略策略(position-(position- independent candidate gene independent candidate gene ap

13、proaches)approaches)（四）定位候选基因克隆（四）定位候选基因克隆(k ln)(k ln)策略策略(positional (positional candidate gene approaches ) candidate gene approaches )第32页/共53页第三十三页，共53页。定义定义 从对一种从对一种(y zhn)(y zhn)致病基因的功能的了解出发，克致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆(k (k ln)ln)应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到生化机制已明确、基因表达产物较易得到(d do

14、)(d do)部分纯化的遗传性疾病。部分纯化的遗传性疾病。第33页/共53页第三十四页，共53页。克隆方式克隆方式(fngsh)(fngsh) 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNAcDNA文库；文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选探针，筛选cDNAcDNA文库。文库。 功能互补功能互补(h b)(h b)试验试验 (functional complementation (functional complementation assay)assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病

15、基因。 第34页/共53页第三十五页，共53页。（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围(fnwi)(fnwi)，最后克隆该基因。，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析( (确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位) )交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常( (缺失、易位等缺失、易位等) )分析、基因文库的筛选分析、基因文库的筛选(shixun)(shixun)与基因克隆与基因克隆第35页/共53页第三十六页，共

16、53页。第36页/共53页第三十七页，共53页。（四）定位候选基因（四）定位候选基因(jyn)(jyn)克隆策略克隆策略当致病基因当致病基因(jyn)(jyn)的染色体定位确认后，的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因人们可以利用因特网上的基因(jyn)(jyn)网站所提供网站所提供基因基因(jyn)(jyn)序列数据，鉴定出候选致病基因序列数据，鉴定出候选致病基因(jyn)(jyn)。第37页/共53页第三十八页，共53页。The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第38页/共53页第三十九

17、页，共53页。转基因技术转基因技术采用采用(ciyng)(ciyng)基因转移技术使目的基因整合基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。入动物子宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的被导入的目的(md)(md)基因基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)(transgenic animal)目的目的(md)(md)基因的受体动物基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术(jsh)第39页/共53页第四十页，共53页。目目 录录第40页/共53页第四十一页，共53页。二、核转移

18、二、核转移(zhuny)技技术术第41页/共53页第四十二页，共53页。基因基因(jyn)(jyn)剔除技术剔除技术也称基因也称基因(jyn)(jyn)靶向靶向(gene (gene targeting)targeting)灭活，有目的去除动物体灭活，有目的去除动物体内某种基因内某种基因(jyn)(jyn)的技术。的技术。三、基因剔除三、基因剔除(tch)技术技术第42页/共53页第四十三页，共53页。第43页/共53页第四十四页，共53页。第第 七七 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip Technology第44页/共53页第四十五页，共53页。DNA芯片

19、芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定是指将许多特定(tdng)的的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片(j yn xn pin)基因芯片基因芯片(j yn xn (j yn xn pin)(gene chip)pin)(gene chip)第45页/共53页第四十六页，共53页。目目 录录第46页/共53页第四十七页，共53页。是将高度密集排列的蛋白是将高度密集排列的蛋白(dnbi)(dnbi)分子分子作为探针点阵固定在固相支持

20、物上，当与待作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白测蛋白(dnbi)(dnbi)样品反应时，可捕获样品中的样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白靶蛋白(dnbi)(dnbi)，再经检测系统对靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白(dnbi)(dnbi)进行定性和定量分析的一种技术。进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片(xn pin)(xn pin)蛋白质芯片蛋白质芯片(xn pin)(protein (xn pin)(protein chip)chip)第47页/共53页第四十八页，共53页。第第 八八 节节蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用研究(ynji)(ynji)技术技术 Research Technology of Interaction of Protein第48页/共53页第四十九页，共53页。蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是