蛋白质样品的初级分离

1、2 蛋白质样品的初级分离蛋白质样品的初级分离混合物分离混合物分离破破 碎碎选选 材材离离 心心沉沉 淀淀萃萃 取取吸吸 附附膜分离膜分离初初 级级 分分 离离（pretreatment）第一节第一节 蛋白质样品的选材与破碎蛋白质样品的选材与破碎1 制备蛋白质的原材料的选择和处理制备蛋白质的原材料的选择和处理n微生物微生物：注意生长期注意生长期 分泌到培养基中代谢产物、胞外酶分泌到培养基中代谢产物、胞外酶 菌体含有的生化物质如胞内酶、核酸菌体含有的生化物质如胞内酶、核酸n植物植物： 去壳、脱脂、品种、季节、生长发育去壳、脱脂、品种、季节、生长发育n动物动物： 含量丰富的脏器组织为原材料含量丰富的

2、脏器组织为原材料 1.1 天然蛋白质的制备材料天然蛋白质的制备材料n对于处理的材料，若不立即进行试验，对于处理的材料，若不立即进行试验，应冷冻保存。应冷冻保存。n对易分解的蛋白质应选用新鲜材料制对易分解的蛋白质应选用新鲜材料制备。备。1.2 重组蛋白质的制备材料重组蛋白质的制备材料 重组蛋白可在重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分为：表达形式一般可分为： （1）细胞外的分泌表达；）细胞外的分泌表达； （2）细胞内可溶性表达；）细胞内可溶性表达； （3）细胞内不溶性表达（包涵体）细胞内不溶性表

3、达（包涵体）1.3 制备蛋白质的原材料的预处理制备蛋白质的原材料的预处理 为了纯化蛋白质，采用有效的方法进行为了纯化蛋白质，采用有效的方法进行组织细胞或培养细胞的破碎是提取胞内蛋组织细胞或培养细胞的破碎是提取胞内蛋白质的关键步骤。白质的关键步骤。1.3.1 细胞的破碎方法细胞的破碎方法依是否外加作用力可分为：依是否外加作用力可分为：n机械破碎法机械破碎法n非机械破碎法非机械破碎法高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎等高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎等化学法、生物法以及渗透压冲击法、化学法、生物法以及渗透压冲击法、冻融法和干燥法等冻融法和干燥法等依所用方法的属性可分为：依所用方法的属性可分为：n物理法：

4、物理法：n化学法化学法n生物法生物法匀浆法、珠磨法、超声法等匀浆法、珠磨法、超声法等渗透冲击和增溶法渗透冲击和增溶法主要是酶溶法主要是酶溶法1.3.1.11.3.1.1机械破碎法机械破碎法高速搅拌珠磨法（高速搅拌珠磨法（fine grinding） 高压匀浆法（高压匀浆法（homogenization）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonication）振荡珠击破碎法振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)1.3.1.11.3.1.1机械破碎法机械破碎法1高速搅拌珠磨法（高速搅拌珠磨法（fine grinding）：）：是将细胞悬浮是将细胞悬浮液与研磨剂（如：玻璃小珠、石英砂或氧化

5、铝等）一起液与研磨剂（如：玻璃小珠、石英砂或氧化铝等）一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出细胞内含物。互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出细胞内含物。 影响珠磨破碎的因素影响珠磨破碎的因素：转盘外缘速率：在一定范围内细胞破碎：转盘外缘速率：在一定范围内细胞破碎的比速率与转盘外缘速率成正比；细胞浓度：该影响目前还没的比速率与转盘外缘速率成正比；细胞浓度：该影响目前还没有定论；磨珠大小及用量：一定范围内，细胞破碎速率与磨珠有定论；磨珠大小及用量：一定范围内，细胞破碎速率与磨珠大小成反比，与磨珠用量成

6、正比。温度：大小成反比，与磨珠用量成正比。温度：540内对破碎物内对破碎物影响较小，但对于热不稳定性产物，应采用冷却装置控温。流影响较小，但对于热不稳定性产物，应采用冷却装置控温。流量：提高流量，则降低细胞的破碎程度和释放蛋白的产量。量：提高流量，则降低细胞的破碎程度和释放蛋白的产量。 珠磨法珠磨法优点优点：可实现连续操作；：可实现连续操作；缺点缺点：破碎中产生大量：破碎中产生大量的热量会使样品迅速升温，需采取冷却装置。适用于真的热量会使样品迅速升温，需采取冷却装置。适用于真菌和藻类细胞。菌和藻类细胞。 是最有效的一种细胞物理破碎法。在工业规模的是最有效的一种细胞物理破碎法。在工业规模的破碎中

7、，常采用高速珠磨机。破碎中，常采用高速珠磨机。1.3.1.11.3.1.1机械破碎法机械破碎法2高压匀浆法（高压匀浆法（homogenization）：）：是利用是利用高压迫使细胞悬浮液通过针型阀后，因高速撞击高压迫使细胞悬浮液通过针型阀后，因高速撞击和突然减压而使细胞破碎的方法。和突然减压而使细胞破碎的方法。操作方式操作方式: 可采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可可采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓连续操作。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。度高或处于

8、生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。影响因素：影响因素：循环次数循环次数(N)： Rm / ( Rm-R) =Np温度：破碎率随温度升高而增加温度：破碎率随温度升高而增加操作压力：细胞破碎速率与操作压力大小成正比操作压力：细胞破碎速率与操作压力大小成正比针型阀与阀座的形状及二者的距离针型阀与阀座的形状及二者的距离优点：优点：可多次循环，操作方便、成本较低。因此，该法可多次循环，操作方便、成本较低。因此，该法已大规模应用于多种微生物细胞，尤其是酵母和细菌。已大规模应用于多种微生物细胞，尤其是酵母和细菌。式中：式中：R为蛋白质释放量，为蛋白质释放量，Rm为蛋白质最大释放量，为蛋白质最大释放

9、量，p为操作压力，为操作压力，是与温度有关的速度常数，是与温度有关的速度常数，为指数值：为指数值：是有机体抵抗破碎能力的一种量度，与生物体的类型及是有机体抵抗破碎能力的一种量度，与生物体的类型及生理状况有关：不同生物其生理状况有关：不同生物其值不同（研究表明酿酒酵值不同（研究表明酿酒酵母母=2.9，大肠杆菌，大肠杆菌=2.21）；而同一微生物，有时所）；而同一微生物，有时所用培养基不同用培养基不同值也会不同（如大肠杆菌生长在复杂培值也会不同（如大肠杆菌生长在复杂培养基上比生长在简单培养基上的养基上比生长在简单培养基上的值大）值大）如：操作温度由如：操作温度由530时，细胞破碎率提高了约时，细胞

10、破碎率提高了约1.5倍，但是，高温破碎只适用于非热变性产物，对于热变倍，但是，高温破碎只适用于非热变性产物，对于热变性物质，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节性物质，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在在20左右左右操作压力不能过高：这是由于破碎过程中能耗与操作压操作压力不能过高：这是由于破碎过程中能耗与操作压力成线性关系，提高压力就要增加能耗，且压力过大会力成线性关系，提高压力就要增加能耗，且压力过大会引起阀座的剧烈破损引起阀座的剧烈破损1.3.1.11.3.1.1机械破碎法机械破碎法3超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonication）：）：是利用超声波是利用超声波振荡

11、器发射的振荡器发射的1525 kHz的超声波探头来处理细胞悬浮的超声波探头来处理细胞悬浮液而使细胞破碎的方法。液而使细胞破碎的方法。破碎原理：破碎原理：在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。胞破碎。影响参数：影响参数：振幅：振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比振幅：振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速率（正相关）；细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑制速率（正相关）；细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑制空穴现象；珠粒的大小：细小珠粒利于空穴的形成

12、，并产生辅空穴现象；珠粒的大小：细小珠粒利于空穴的形成，并产生辅助助“研磨研磨”效应，从而提高破碎速率。其它：如：探头的形状效应，从而提高破碎速率。其它：如：探头的形状和材料，细胞悬浮液的流速、体积等。和材料，细胞悬浮液的流速、体积等。特点：特点：该法是一种强烈的破碎细胞的方法，操作简便，液体量损该法是一种强烈的破碎细胞的方法，操作简便，液体量损失少，适用于多种微生物细胞。但是超声处理易使敏感型活性物失少，适用于多种微生物细胞。但是超声处理易使敏感型活性物质失活，操作过程产热大，对冷却装置要求苛刻，故不易放大，质失活，操作过程产热大，对冷却装置要求苛刻，故不易放大，目前仍主要应用于实验室研究。

13、目前仍主要应用于实验室研究。 1.3.1.11.3.1.1机械破碎法机械破碎法4振荡珠击破碎法振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)：将等体积的小量将等体积的小量组织样品与高密度的组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的放入可密封的2ml螺螺旋盖微量管中旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积的体积, 用用6500RPM振荡机高速上下振动振荡机高速上下振动8秒秒,休息休息8秒秒,再振动再振动8秒即可秒即可.是目前最快且一次可处理最多样品的方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最一台机器最多可以一天处理多可以一天处理2400支样

14、品支样品.对小量且多样的人很方便对小量且多样的人很方便.机械法破碎细胞的缺陷机械法破碎细胞的缺陷 需要高能量，并且产生高温和高剪切力，因此易使需要高能量，并且产生高温和高剪切力，因此易使不稳定产品变性失活；不稳定产品变性失活；破碎目标不具专一性（被破碎的有机体或释放产物破碎目标不具专一性（被破碎的有机体或释放产物是非专一的）、易形成碎片颗粒，这为后续分离纯化是非专一的）、易形成碎片颗粒，这为后续分离纯化工作带来难度。工作带来难度。 1.3.2.21.3.2.2非机械破碎法非机械破碎法化学破碎法化学破碎法生物破碎法（酶溶法）生物破碎法（酶溶法）物理法物理法1.3.1.21.3.1.2非机械破碎法

15、非机械破碎法1）化学破碎法化学破碎法：采用化学法处理可以溶解细胞或抽：采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。这种用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提提胞内组分。这种用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞内某些组分的方法就称为化学破碎法细胞内某些组分的方法就称为化学破碎法 。作用机理作用机理：表面活性剂、变性剂等化学试剂可以改变：表面活性剂、变性剂等化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。 常用化学试剂：酸、碱、表面活性剂、变性剂、金属常用化学试剂：酸、碱、表面活性剂、变性剂、金属螯合剂、和某些有机溶剂（如苯、甲苯）等。螯合剂、和

16、某些有机溶剂（如苯、甲苯）等。常用化学破碎法：常用化学破碎法：渗透压冲击法渗透压冲击法、增溶法增溶法和和脂溶法脂溶法等。等。 渗透压冲击法：将细胞首先置于渗透压冲击法：将细胞首先置于高渗介质高渗介质，由于渗透压的作用，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，待达到平衡后，将介质细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，待达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞快速转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然快速稀释，或将细胞快速转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，且

17、操作简单，但仅适用渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，且操作简单，但仅适用于细胞壁较脆弱的、经酶需处理的、或细胞壁合成受抑制而强于细胞壁较脆弱的、经酶需处理的、或细胞壁合成受抑制而强度减弱的菌体细胞。度减弱的菌体细胞。是用表面活性剂处理细胞，利用其增溶作用，增加细胞壁和膜是用表面活性剂处理细胞，利用其增溶作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎的方法。此技术可与研磨法联合使用。常的通透性使细胞破碎的方法。此技术可与研磨法联合使用。常用的表面活性剂：用的表面活性剂：SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)、Triton X-100等。等。 许多有机溶剂能与细胞壁和膜的脂质作用，从而导致细胞壁膨许多有机

18、溶剂能与细胞壁和膜的脂质作用，从而导致细胞壁膨胀、破裂，释放出内含物。常用的脂溶剂：氯仿、甲苯、丙酮胀、破裂，释放出内含物。常用的脂溶剂：氯仿、甲苯、丙酮等。此技术也可以与研磨法联合使用。等。此技术也可以与研磨法联合使用。 化学破碎法的特点化学破碎法的特点存在的问题存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 优点优点：

19、多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。核酸时，常用此法破碎细胞。1.3.2.21.3.2.2非机械破碎法非机械破碎法2）生物破碎法（酶溶法）生物破碎法（酶溶法）：是利用生物酶消化溶解：是利用生物酶消化溶解细胞壁和膜，从而导致细胞壁膨胀、破裂，释放出内细胞壁和膜，从而导致细胞壁膨胀、破裂，释放出内含物的方法。含物的方法。常用的溶酶常用的溶酶：溶菌酶、：溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1,6-葡聚糖葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、纤维酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等。素酶、蜗牛酶

20、和酯酶等。自溶自溶：将新鲜的生物材料存放于一定的：将新鲜的生物材料存放于一定的pH 和适当的和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶的作用温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶法。法。自溶是一种特殊的酶溶方式自溶是一种特殊的酶溶方式。优点：优点：作用条件温和；细胞壁损坏的程度可以控作用条件温和；细胞壁损坏的程度可以控制；内含物成分不易受到破坏；产物可选择性释制；内含物成分不易受到破坏；产物可选择性释放；适用多种微生物。放；适用多种微生物。缺点：溶酶价格高，回收利用困难，大规模使用成本太高

21、；缺点：溶酶价格高，回收利用困难，大规模使用成本太高；通用性差，不同的菌种需选择不同的酶，且最佳条件不易确通用性差，不同的菌种需选择不同的酶，且最佳条件不易确定；存在产物抑制作用：这可能是导致胞内物质释放率低的定；存在产物抑制作用：这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。一个重要因素。 酶解破碎适用于多种微生物酶解破碎适用于多种微生物 ，但目前仍局限于实验室规模应，但目前仍局限于实验室规模应用。用。另外，另外，溶酶有高度的专一性溶酶有高度的专一性，如溶菌酶主要作用于细菌细，如溶菌酶主要作用于细菌细胞，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶。如：将酵母细胞悬于胞，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶。如：

22、将酵母细胞悬于0.1mmol/L 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.4)中，加中，加1蜗蜗牛酶，在牛酶，在30处理处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂。分钟，即可使大部分细胞壁破裂。 例如：酵母在例如：酵母在4550下保温下保温20h左右，即可发生自溶。左右，即可发生自溶。但该法使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使但该法使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也有可能会把某些要提取的有效细胞壁和膜破坏，同时也有可能会把某些要提取的有效成分分解。另外，自溶的时间较长，不易控制，故在制成分分解。另外，自溶的时间较长，不易控制，故在制备生物活性时

23、很少用之。备生物活性时很少用之。1.3.1.21.3.1.2非机械破碎法非机械破碎法3）物理法物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。的方法。常用的物理法：常用的物理法：反复冻融法反复冻融法、急热骤冷法急热骤冷法和和干燥法干燥法等。等。 是将细胞放在低温（是将细胞放在低温（-15），然后在室温中融化，反复），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。多次，细胞壁破裂。原理原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及剩余细胞液的盐浓度的突然增高，造成胞内外溶形成及剩余细胞液的盐浓度的突然增高，造成胞内外溶剂浓度的突然改变而引起溶胀，使

24、细胞结构破碎而破坏剂浓度的突然改变而引起溶胀，使细胞结构破碎而破坏细胞。细胞。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。因此，反复冻融在实际操作中最好与超声波破碎胞作用较差。因此，反复冻融在实际操作中最好与超声波破碎或酶解一起使用，否则冻融后黏度很大，蛋白质容易聚集，通或酶解一起使用，否则冻融后黏度很大，蛋白质容易聚集，通常都是反复冻融后超声波处理。常都是反复冻融后超声波处理。 先将材料在先将材料在90左右的水浴中维持数分钟，立即放入冰浴中使左右的水浴中维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞

25、可以被破碎。细菌或病之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此技术。毒中提取蛋白质和核酸时可用此技术。 经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。物质就会被抽提出来。 小结小结 众多细胞破碎方法中，众多细胞破碎方法中，高压均浆高压均浆和和珠磨珠磨两种机械破碎方法，处两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛目前在工业生长

26、上应用最广泛。但在机。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声超声波振荡法波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。 非机械法非机械法一一般仅适用于小规模应用般仅适用于小规模应用。渗透压冲击。渗透压冲击和和冻结融解法冻结融解法都属于较都属于较温和的方法，但温和的方法，但破碎作用较弱，它们常与酶解法结合起来使用，破碎作用较弱，它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。提高破碎效果。干燥

27、法干燥法属于较激烈的一种破碎方法，属于较激烈的一种破碎方法，容易引起容易引起蛋白质或其它组分变性蛋白质或其它组分变性。 各种组织适用的细胞破碎方法各种组织适用的细胞破碎方法 细胞破碎方法细胞破碎方法组织种类组织种类旋刀式匀浆旋刀式匀浆大多数动植物组织大多数动植物组织手动式匀浆手动式匀浆柔软的动物组织柔软的动物组织超声超声细胞混悬液细胞混悬液高速匀浆高速匀浆细菌、酵母植物细胞细菌、酵母植物细胞研磨研磨细菌、植物细胞细菌、植物细胞高速珠磨高速珠磨细胞混悬液细胞混悬液酶溶酶溶细菌、酵母细菌、酵母去垢剂渗透去垢剂渗透 组织培养细胞组织培养细胞有机溶剂渗透有机溶剂渗透细菌、酵母细菌、酵母低渗裂解低渗裂解

28、红细胞、细菌红细胞、细菌冻融裂解冻融裂解培养细胞培养细胞细胞细胞 声波声波 机械机械 渗透压渗透压 冻融冻融动植物动植物 + + + + + + +革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 + + + + + + +革兰氏阳性芽孢菌革兰氏阳性芽孢菌 + + + + + + +酵母酵母 + + + + + + +革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌 + - + + - + +菌丝菌丝 - + - +- + - +孢子孢子 - - - -1.3.1.3选择破碎方法的依据选择破碎方法的依据n细胞的处理量细胞的处理量 n细胞的密度和细胞壁的强度细胞的密度和细胞壁的强度n目标产物对破碎条件的敏感性以及目标产物对破碎条件的敏感性

29、以及产物在产物在细胞中的位置细胞中的位置n破碎程度破碎程度 n产物的稳定性产物的稳定性 n提取分离的难易提取分离的难易 其一般原则为：目标产物若在细胞其一般原则为：目标产物若在细胞质内，需用机械破碎法；若细胞膜质内，需用机械破碎法；若细胞膜附近，则可选用较温和的非机械法；附近，则可选用较温和的非机械法；若与细胞膜或壁相结合，则可采用若与细胞膜或壁相结合，则可采用机械法和化学法相结合的方法。机械法和化学法相结合的方法。 1.1.直接测定破碎前后的细胞数：直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与

30、完整细胞。破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.2.测定导电率：测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。 1.3.1.4 细胞破碎确认细胞破碎确认 细胞破碎率的评价细胞破碎率的评价破碎率：破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：百分比数，即： Y(%)=(N0-N) / N0100 。注：注： N0 原始细胞数量；原始细胞

31、数量；N经经t时间操作后保留下时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。来的未损害完整细胞数量。 细胞破碎率的计算方法细胞破碎率的计算方法 N0和和N主要通过主要通过直接计数法直接计数法和和间接计数法间接计数法两两种方法获得。种方法获得。 通过平板计数技术或在血球计数板上用显微镜观察法通过平板计数技术或在血球计数板上用显微镜观察法直接对适当稀释后的样品进行计数直接对适当稀释后的样品进行计数 是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通常做法：通常做法：将破将破碎后的细胞悬浮液离心分离

32、掉固体（完整细胞和碎碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。其法测量上清中的蛋白质含量。其破碎率可通过被释放出来化合物的量破碎率可通过被释放出来化合物的量R与所有细胞的与所有细胞的理论最大释放量理论最大释放量Rm之比进行计算。之比进行计算。 作作 用用 方方 法法机械机械液体剪切液体剪切 超声波超声波 机械搅拌压力机械搅拌压力固体剪切固体剪切 研磨研磨杆和臼杆和臼 球磨机球磨机压力压力Hughes压榨机压榨机 X 压榨机压榨机非机械非机械 脱水脱水空气干燥空气干燥 真空干燥真空干燥 冷冻干燥冷冻干燥 溶剂干燥溶剂干燥溶胞作用溶胞作

33、用 物理作用物理作用渗透冲击渗透冲击 压力释放压力释放 冻结和融化冻结和融化化学作用化学作用阳阴离子洗涤剂阳阴离子洗涤剂 抗生素抗生素 甘氨酸甘氨酸酶作用酶作用溶菌酶和有关的酶噬溶菌酶和有关的酶噬 菌体溶胞菌体溶胞 抗菌素抗菌素第二节 目标蛋白质的离心分离目标蛋白质的离心分离 离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。2.1 2.1 离心技术的原理离心技术的原理 将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为生物大分子等称为“颗粒颗粒”。每个颗粒都。每个颗粒都有一定有一定大小

34、、形状、密度和质量大小、形状、密度和质量。当离心。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。上的力的大小和力的方向有关。 离心力：离心力： Fc = m ac m r r 2 2 m r r （2 N/60）2 2 N为离心机为离心机每分钟转数每分钟转数 （r/min ）；）； Fc通常以相对离心力通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，即离心力表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数的大小相当于地球引力（重力

35、常数g）的多）的多少倍。少倍。一般用一般用g g（或数字（或数字 g g）表示。）表示。2.1.1 2.1.1 相对离心力相对离心力RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用旋转半径用r r平均平均代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小小）cmcm 通通 常：常：低速离心以低速离心以每分钟的转数每分钟的转数表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min。高速离心（超速），常以高速离心（超速

36、），常以相对离心力相对离心力（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000g。 两者可换算或查测算图。两者可换算或查测算图。计算近似计算近似RCF的列线图的列线图2.1.2 沉降系数沉降系数:（sedimentation constant） 指单位离心力下颗粒的沉降速度指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentation velocity）, ,用用S表示表示。 由于许多生物大分子的由于许多生物大分子的S S值很小，所以定值很小，所以定义义10 10 13 s 为一个沉降单位，为一个沉降单位，1S = 1 10 13 s。 常用常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚表示某些生

37、物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系，蛋白质的沉降系数一般在数一般在1 200之间。之间。 2.1.3 离心条件的确定离心条件的确定 离心力离心力 离心时间（与颗粒的沉降时间有关）离心时间（与颗粒的沉降时间有关） 温度和温度和pH值（防止欲分离物质的凝集、值（防止欲分离物质的凝集、变性和失活）变性和失活） n：转子每分钟转数，r/min 36004222rnmrmF2.2 2.2 离心机的种类离心机的种类 按离心机转速的不同，分为：按离心机转速的不同，分为： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速 名称名称 转速转速(r/min)(r/min)

38、 注意事项注意事项 低速离心机低速离心机 60006000 常温，注意样品热变性和常温，注意样品热变性和离心管平衡离心管平衡 高速离心机高速离心机 60006000 2500025000冷冻（防止温度升高），冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 超速离心机超速离心机 2500025000冷冻真空系统（减少空冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），气阻力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 离心机的种类离心机的种类 l温度类型：温度类型：常温及常温及冷冻冷冻l超速离心机均为冷超速离心机均为冷冻型。冻型。l使用冷冻离心机时使用冷冻离心机时提前降温，预冷离提前降温，预冷离心头。心

39、头。l使用超速离心机时使用超速离心机时先抽真空。先抽真空。l角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式及外摆式：外摆式一般为低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。作注意稳、盖、旋紧。l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l强度：和离强度：和离心速度相配心速度相配l大小：和转大小：和转子配套子配套l高速超速管高速超速管要加盖要加盖l平衡、定温、定速、定时。平衡、定温、定速、定时。2.3 2.3 离心分离技术的种类离心分离技术的种类 差速离心法是指通过不断差速离心法是指通过不断增加相对离心力增加

40、相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心方法。及不同离心时间下分批离心方法。差速离差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒粒。主要用于分离细胞器和病毒。主要用于分离细胞器和病毒。 差速离心法差速离心法(differential centrifugation) 密度梯度离心法密度梯度离心法 亦称亦称平衡密度梯度离心法平衡密度梯度离心法。密度梯度离。密度梯度离心法包括心法包括速度区带速度区带和和等密度离心等密度离心二种方二种方法。后者又可分为预制梯度等密度及自法。后者又可分为预制梯度等密度及

41、自形成梯度等密度两种方法。形成梯度等密度两种方法。 速度区带离心法速度区带离心法 在在离心前离心管内预先装入密度梯度介质离心前离心管内预先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等等)，待分离，待分离的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间，的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间，同梯度液一起离心。由于离心力的作用，同梯度液一起离心。由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管按不同沉降速度向管底沉降底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连形成一系列界面清楚的不连续区带续区带。沉降

42、系数越大，往下沉降越快，。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。则在较上部分依次出现。 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心等密度离心法等密度离心法 某些密度梯度介质经过离心后会自身形成某些密度梯度介质经过离心后会自身形成梯度，如细胞分离液梯度，如细胞分离液Percoll。待分离样品。待分离样品可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于离心力的作用离心力的作用逐渐形成管逐渐形成管底部浓底部浓而而管顶稀管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗粒也

43、发生重新分布。当管底介质的密度大粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度时，颗粒上浮；当管顶介质于颗粒的密度时，颗粒上浮；当管顶介质的密度小于颗粒的密度时，则颗粒沉降；的密度小于颗粒的密度时，则颗粒沉降；最后颗粒进入到一个它本身的密度位置，最后颗粒进入到一个它本身的密度位置，颗粒不再移动，形成稳定的区带。颗粒不再移动，形成稳定的区带。 2.4 超速离心超速离心 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质，也可以用作测定用来分离纯化蛋白质，也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质的分子量。 超速：超速：50000-120000rpm大容量冷冻

44、离心机2.5 应用应用 根据不同离心目的，分为根据不同离心目的，分为制备性离心：制备性离心： 分离纯化和制备分离纯化和制备分析性离心：分析性离心： 测分子量、沉降系数、密度、纯度测分子量、沉降系数、密度、纯度第三节第三节 蛋白质的沉淀分级蛋白质的沉淀分级 概念概念 溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。 本质本质 通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在 液液相中的溶解度，增加了固相中的分配率。相中的溶解度，增加了固相中的分配率。 作用作用 分离、澄清、浓缩、保存分离、澄清、浓缩、保存3.1 沉淀技术沉淀技术3.2 沉淀的分类沉

45、淀的分类大大小小0.1 1 m0.02 m大大小小G.G. Chen et al. Powder Technology 139 (2004),180-185.溶剂性质对沉淀的影响溶剂性质对沉淀的影响3.3 沉淀的形成过程沉淀的形成过程文献选读文献选读文献选读无定形沉淀形成示意无定形沉淀形成示意晶形沉淀过程示意SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-

46、SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO

47、42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+S

48、O42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-

49、SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+成核作用成核作用Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-AgAgCr2O7CrO4AgAgKQSS初始速度Q 瞬时浓度瞬时浓度S 晶核的溶解度晶核的溶解度，相相对对过过饱饱和和度度SSQ lgNQ异相成核异相成核异相成核异

50、相成核均相成核均相成核临界点临界点3.4 3.4 沉淀微粒大小的影响因素沉淀微粒大小的影响因素3.5 沉淀的纯度沉淀的纯度表面吸附表面吸附例例Ba2+SO42-沉淀沉淀用用SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ca2+Ca2+NO3-Cl-Cl-Cl-K+Na+SO42-SO42-吸附层吸附层溶解度溶解度(mol/L)：25CNa2SO4 1.4K2SO4 0.64CaSO4 3.610-4BaSO4 10-5Ca(NO3)2 3.2CaCl2 9.4Ca2+NO3-Cl-K+Na+表面吸附影响因

51、素表面吸附影响因素例：以氨水沉淀例：以氨水沉淀Fe(OH)3时，时，Ca2+ 、Mg2+ 、 Zn2+ 、 Ni2+ 4种种杂质离子的吸附量的变化示意如图杂质离子的吸附量的变化示意如图吸附百分数吸附百分数c(NH4Cl)0固定固定c(NH3)CaMgZnNi吸附百分数吸附百分数c(NH3)0固定固定c(NH4Cl)CaMgZnNi包藏包藏 occlusion杂质离子100 mol BaSO4中沾污盐的量n/mol1000g 水中沾污盐的溶解量n/molBa2+加到SO42-中SO42- 加到Ba2+中I-Br -Cl -ClO3 - NO3 -Na+ Ca2+0.0050.350.452.75

52、.49.915.90.0321.652.79.819.64.13.65.643.551.831.370.463.00.02（30C)混晶或固溶体混晶或固溶体后沉淀后沉淀例，在例，在0.01 mol/L Zn2+的的0.15 mol/L HCl，通，通H2S, ZnS形形成过饱和溶液，若加入成过饱和溶液，若加入Cu2+ZnCuSSS共沉淀与后沉淀对分析结果的影响的处理共沉淀与后沉淀对分析结果的影响的处理 3.6 3.6 沉淀条件的选择沉淀条件的选择晶形沉淀晶形沉淀稀稀热热慢慢搅搅陈陈相对过饱和度小，减少均相成核；相对过饱和度小，减少均相成核；减少杂质吸附量减少杂质吸附量增大溶解度，减少相对过饱和

53、度，减少均相成核；增大溶解度，减少相对过饱和度，减少均相成核；增大扩散速度，有利于沉淀长大；增大扩散速度，有利于沉淀长大；减少吸附减少吸附减少均相成核；减少均相成核； 有利于沉淀长大有利于沉淀长大减少包藏；减少包藏；晶形完整化晶形完整化控制相对过饱和度小，沉淀陈化控制相对过饱和度小，沉淀陈化无定形沉淀无定形沉淀减少水合，使其聚集紧密，便于减少水合，使其聚集紧密，便于过滤；减少杂质吸附过滤；减少杂质吸附减少水合，减少吸附，防止胶溶减少水合，减少吸附，防止胶溶减少水合。减少水合。沉淀完后，稀释搅拌，减少杂沉淀完后，稀释搅拌，减少杂质吸附质吸附减少水合减少水合利于凝聚、沉降利于凝聚、沉降3.7 沉淀

54、方法分类沉淀方法分类 盐析盐析 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 等电点沉淀等电点沉淀 非离子聚合物沉淀非离子聚合物沉淀 其他沉淀技术其他沉淀技术生成盐复合物生成盐复合物选择性变性选择性变性亲和沉淀亲和沉淀3.7.1 盐析盐析3.7.1.1 原理原理 “盐溶盐溶” 低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。溶解度增大。 “盐析盐析” 中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列，活中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜

55、被破坏，度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。从而聚集沉淀。影响盐析的因素影响盐析的因素 盐离子种类和浓度盐离子种类和浓度 生物分子种类和浓度生物分子种类和浓度 pH值值 温度温度3.7.1.2 公式和讨论公式和讨论 纯蛋白质有盐析经验公式：纯蛋白质有盐析经验公式：log S = kSIS 蛋白质溶解度（蛋白质溶解度（g/L）；）； I=0时时log S，它取决于盐和，它取决于盐和Pr的性质，温度，的性质，温度，pH；kS 盐析常数，决定于加入盐性质及盐析常数，决定于加入盐性质及Pr性质；性质；I 盐浓度（盐浓度（mol/L）原始浓度原始浓度P P小，盐析所需小，盐析所需

56、I高；高；P大，盐析所需大，盐析所需I低低 对混合对混合Pr的盐析，的盐析，P大，会发生严重共沉作用，一大，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为般控制浓度为2.53%。混合混合Pr的盐析的盐析 合适盐析范围的选择合适盐析范围的选择 不同不同Pr盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。 改变原始浓度改变原始浓度 一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化 二次盐析二次盐析 在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。能除去难溶杂质。3.7.1.3 盐析操作要点盐析操作要点 可使用的中性盐有

57、：可使用的中性盐有：(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4 NaCl 、NaAc 、 Na3PO4 、柠檬酸钠等、柠檬酸钠等 以以(NH4)2SO4 、Na2SO4最广泛，前者最受欢迎最广泛，前者最受欢迎盐的种类及选择：盐的种类及选择：盐析范围的确定盐析范围的确定 可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑）线测得。（从回收率和纯度考虑）确定盐析范围举例确定盐析范围举例 取小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来取小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围确定范围盐的加入方式盐的加入方式 固体固体 缓慢加，防泡沫，要平衡缓慢加，防泡沫，要平

58、衡 液体液体（饱和盐溶液）（饱和盐溶液） 要求盐析范围小于要求盐析范围小于50%饱和度饱和度 盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置完后，应放置30min以上才可进行固以上才可进行固-液分离。液分离。 透析盐析透析盐析 将将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使续性变化，使Pr沉淀。沉淀。 反抽提法（反抽提法（Back-Extraction） 将包括要分离的将包括要分离的Pr在内的多种在内的多种Pr一起沉淀出一起沉淀

59、出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。提沉淀物。3.7.1.4 盐析操作的其他方法盐析操作的其他方法3.7.1. 5 沉淀的再溶解沉淀的再溶解将沉淀溶于下一步所需的缓冲液将沉淀溶于下一步所需的缓冲液（12倍）倍）3.7.1. 6 脱脱 盐盐 透析透析 超滤超滤 根据所加操作压所用膜平均孔径的不根据所加操作压所用膜平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透。同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透。 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 此法脱盐时间短，效果好。此法脱盐时间短，效果好。3.7.2 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀3.7.2.1 基本原理基本原理 使溶液的介

60、电常数大大降低，从而增加使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；介电常数与静电引力的关系，可用淀；介电常数与静电引力的关系，可用库仑公式表示库仑公式表示: 争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀。破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀。几种溶剂的介电常数几种溶剂的介电常数3.7.2.2 特特 点点 优点优点 分辨能力比盐析高分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐