发酵工程期末复习题八至十五章以及固态发酵

1、江南大学 08级强化班发酵工程期末复习题sunriben2011/1/3第八章1， 发酵过程的定义发酵过程即细胞的生物反应过程，是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应过程。它不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且还包括固定化细胞的反应过程、生物法废水处理过程和细菌采矿等过程。2， 为何要研究发酵过程微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论

2、基础。同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。 3， 发酵过程的主要控制参数主要分为哪三大类物理参数、化学参数、生物参数 4， 发酵过程中通常测定的参数有哪些温度、罐压、空气流量、搅拌转速、pH、溶氧、基质浓度、菌体浓度5， 发酵过程中参数测定的方法有哪两种在线测定 离线测定6， 简述发酵过程的代谢变化规律。为什么要了解这一规律。定义：？代谢变化是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件

3、等）和产物形成速率三者间的关系。原因：了解生产菌种在具有合适的培养基、pH、温度和通气搅拌等环境条件下对基质的利用、细胞的生长以及产物合成的代谢变化，有利于人们对生产的控制7， 分批发酵、补料分批发酵和连续发酵的定义。对这三种发酵方式进行比较。分批发酵： 是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖. 特点 微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。 优点： 操作简单； 操作引起染菌的概率低。 不会产生菌种老化和变异等问题 缺

4、点 非生产时间较长、设备利用率低。 补料分批发酵 又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。 优点： 使发酵系统中维持很低的基质浓度； 和连续发酵比、不需要严格的无菌条件； 不会产生菌种老化和变异等问题。 缺点： 存在一定的非生产时间； 和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。 连续发酵 培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。 优点： 能维持低基质浓度； 可以提高设备利

5、用率和单位时间的产量； 便于自动控制。 缺点： 菌种发生变异的可能性较大； 要求严格的无菌条件。8 按照产物生成与菌体生长是否同步，可将分批发酵分为哪两种类型，并 用公式进行表述。这种分类方法对实际生产有何指导意义生长关联性 非生长关联性l 如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；l 如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。9，代谢变化、代谢曲线 代谢变化是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。把它

6、们随时间变化的过程绘制成图，就成为所说的代谢曲线。10，温度对发酵过程有何影响？ 影响各种酶的反应速率和蛋白质性质 影响发酵液的物理性质影响生物合成的方向11，pH值对发酵过程有何影响？ pH影响酶的活性 pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态 pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解 pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变12，简述发酵过程中引起pH下降和上升的因素 下降v 碳源过量v 消泡油添加过量v 生理酸性物质的存在上升v 氮源过多v 生理碱性物质的存在v 中间补料，碱性物质添加过多13， 发酵过程中pH的控制方式。调节基础培养基的配方l 调节碳氮比（C/N

7、）l 添加缓冲剂 补料控制l 直接加酸加碱l 补加碳源或氮源14，发酵过程中泡沫产生的原因ü 由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌）；ü 发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）。15，发酵过程中泡沫的产生有何不利的影响v 降低发酵设备的利用率v 增加了菌群的非均一性v 增加了染菌的机会v 导致产物的损失v 消泡剂会给后提取工序带来困难16，在发酵过程中影响泡沫稳定性的因素有哪些v 培养基的配比及原材料组成 v 通气与搅拌的强度 v 培养基的破坏程度 v 接种量的大小v 培养液本身性质的变化v 培养基灭菌的方法和操作v 染菌17，发酵过程中泡沫控制的方法。 物理消

8、沫法 化学消沫法18，化学消泡的机理。n 当泡沫的表层存在着由极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强曲？；或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。n 当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。19，发酵过程中补料控制的目的，所补的物料包括哪些类型，补料的原则及控制策略 目的：v 解除基质过浓的抑制v 解除产物的反馈抑制v 解除葡萄糖分解代谢阻遏效应 类型：Ø 补充微生物能源和碳源的需要。Ø 补充菌体所需要的

9、氮源。Ø 补充微量元素或无机盐。 原则：1.控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。2.为实现这一目标，在中间补料控制时，必须选择恰当的反馈控制参数和补料速率控制策略： 大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质 以经验数据或预测数据控制流加； 以pH、尾气、溶氧、产物浓度等参数间接控制流加； 以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基 质的浓度，间接控制流加； 用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加。20，临界氧浓度 指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。21，请叙述发酵过程中溶解氧的一般变化规律。n 发酵前期

10、：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降 n 发酵中后期，溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等 n 发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升 22，二氧化碳对发酵的影响及其机理，发酵过程如何控制二氧化碳 影响：CO2对菌体具有抑制作用，当排气中CO2的浓度高于4%时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。CO2对发酵也有影响Ø 对发酵促进。如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2 。Ø 对发酵抑制。如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等发酵的抑制影响

11、发酵液的酸碱平衡。机理：CO2及HCO3-主要是影响细胞膜的结构，导致膜的流动性及表面电荷密度发生改变，影响到细胞膜的输送效率，导致细胞生长受到抑制、形态发生改变。培养液中的CO2主要作用于细胞膜的脂质核心部位；HCO3-影响细胞膜的膜蛋白。 控制：通过调节通风和搅拌来控制。23，发酵过程的基本自控系统包括哪些前馈控制；后（反）馈控制；自适应控制24，发酵动力学的定义，研究发酵动力学的目的。Ø 发酵动力学：研究各种发酵过程变量在活细胞的作用下变化的规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。并以数学，工程学的原理，定量描述。目的：Ø 通过动力学研究，优化发酵的工艺条件及

12、调控方式；（研究各种物理，化学因素的影响，为调控提供依据） 建立反应过程的动力学模型来模拟最适当的工艺流程和工艺参数， 预测反应的趋势； 控制发酵过程，甚至用计算机来进行控制。 25，研究发酵动力学方法有哪两种？ 宏观处理法 结构动力学模型（通过研究微观反应机制建立） 非结构动力学模型（不考虑微观反应机制，只考虑宏观变量之间的关系） 质量平衡法（根据质量守恒定律） 物质在系统中的积累速度=物质进入系统速度+物质在系统中生成的速度-物质在系统中排除的速度-物质在系统中消耗的速度26，简述Monod方程与米氏方程的区别与联系。根据实验结果计算Monod方程的参数Monod方程是对实验现象的总结 是

13、经验方程（empirical model） 米氏方程是根据酶反应机理推导得出 是机理方程（mechanistic model ） Monod方程与米氏方程的相似性。PS: Monod方程应满足(1)菌体生长为均衡型非结构生长;(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物；(3)菌体产率系数恒定。27，恒化器和恒浊器的定义。ü 恒化器： 以某种必需营养作为生长限制基质，通过控制流加速率造成适应这种条件的细胞生长密度和生长速率，培养液中限制性底物浓度保持恒定。ü 恒浊器： 通过控制生长限制性基质的流量维持恒定的菌体密度。28，在连续培养过程中，其实际结果为何会和理论推导的结果发生

14、偏差ü 限制性基质为碳源时，部分消耗的碳源作为能量供生命活动，X偏低；ü N，S为限制性基质，D较小时会积累多糖，脂肪等，X偏高；ü Mg, P,K为限制性基质时，同上，但细胞内这些物质下降，YX/S增大，细胞浓度偏高；ü 复合培养基时，情况复杂，随着变化，限制性基质会改变，X下降。29，宏观产率系数 宏观产率系数(或称得率系数)Yi/j是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，其中i表示菌体或产物，j表示底物 例如，菌体对底物的产率系数可表示为：30，理论代谢产物产率的计算 假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP

15、/S可达理论最高值，称为理论代谢产物产率31，分批发酵、补料分批发酵和连续发酵动力学方程的推导32，研究连续培养动力学有何用途 确定最佳培养条件 富集，选育特殊形状菌种建立选择性的培养环境生长速率不同的菌种在连续培养中的“去”“留”。第九章 厌氧发酵设备1、酒精发酵设备的基本要求 满足酒精发酵的工艺要求 满足酒精酵母生长和代谢的必要工艺条件 将发酵产生的热量及时移走 有利于发酵液的排出，设备的清洗、维修以及设备制造安装方便等问题。 2、酒精发酵罐的冷却装置有哪三种形式？ 中小型发酵罐：多采用罐顶喷水淋于罐外壁表面进行膜状冷却； 大型发酵罐：由于罐外壁冷却面积不能满足冷却要求，所以，罐内装有冷却

16、蛇管或罐内蛇管和罐外壁喷洒联合冷却装置。 此外，也有采用罐外列管式喷琳？冷却的方法，此法具有冷却发酵液均匀、冷却效率高等优点。 3、微生物在厌氧发酵过程中总的发酵热 （1）总发酵热的估算 微生物在厌氧发酵过程中总的发酵热，一般由生物合成热Q1，蒸发热损失Q2， 罐壁向周围散失的热损失Q3等三部分热量所组成。即： Q= Q1 -（ Q2 + Q3 ） Q1的估算Ø 按发酵最旺盛时单位时间糖度降低的百分值来计算Ø 计算方法：在发酵最旺盛时，测定小型试验箱冷却水的进出口温度和单位时间内的耗水量，从而得出其放热量（Q1）。由Q1扩大到生产罐，则生产罐的Q1为： Q1= WC(t2-

17、t1)Q2一般取Q1的5%6%左右。Q3这部分热量由对流和辐射组成，可查阅相关手册。4、酒精发酵罐罐数的计算 对于间歇发酵，发酵罐罐数可按下式计算： 式中 N：发酵罐个数（个） 1表示备用 n：每24小时内进行加料的发酵罐数 t:发酵周期（小时）5、啤酒圆筒体锥底发酵罐的优缺点优点： 加速发酵，发酵和传统发酵相比，由于发酵基质(麦汁)和酵母对流获得强化，可加速发酵。 厂房投资节省。 冷耗节省。 C.C.T 发酵可依赖CIP自动程序清洗消毒，工艺卫生更易得到保证。 缺点： 由于罐体比较高，酵母沉降层厚度大，酵母泥使用代数一般比传统低(只能使用56代)； 贮酒时，澄清比较困难(特别在使用非凝聚性酵

18、母)，过滤必须强化； 若采用单酿发酵，罐壁温度和罐中心温度一致，一般要57d以上，短期贮酒不能保证温度一致 第十章 通风发酵设备1，常用的通风发酵罐有哪几种类型 机械通风搅拌发酵罐 气升式发酵罐 自吸式发酵罐 伍式发酵罐 文氏管发酵罐2，机械搅拌发酵罐的基本要求 1.发酵罐应具有适宜的径高比。 2.发酵罐能承受一定压力。 3.发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合,保证发酵液必须的溶解氧。 4.发酵罐应具有足够的冷却面积。 5.发酵罐内应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底，避免染菌。 6.搅拌器的轴封应严密，尽量减少泄漏.3，机械搅拌发酵罐的搅拌器的作用和种类 搅拌器的作用是打碎气泡，使空气

19、与溶液均匀接触，使氧溶解于发酵液中。 搅拌器有轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向式（涡轮式）两种。4，挡板的作用挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧5，全挡板条件？是指在一定转数下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。6，消泡器的作用和种类消泡器的作用是将泡沫打破。消泡器常用的形式有锯齿式、梳状式及孔板式。孔板式的孔径约1020毫米。Ps：消泡器的长度约为罐径的0.65倍7 发酵罐上常用的轴封有哪两种，比较其优缺点 轴封的作用是使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄漏和污染杂菌。常用的轴封有填料函和端面轴封两种。端面式轴封又称机械轴封。填料函式轴封的优点：

20、结构简单。主要缺点是：死角多，很难彻底灭菌，容易渗漏及染菌；轴的磨损情况较严重；填料压紧后摩擦功率消耗大；寿命短，经常维修，耗工时多。端面式轴封的优点：清洁；密封可靠；无死角，可以防止杂菌污染；使用寿命长；摩擦功率耗损小；轴或轴套不受磨损； 对轴的精度和光洁度没有填料密封要求那么严格，对轴的震动敏感性小。端面式轴封的缺点：结构比填料密封复杂，装拆不便；对动环及静环的表面光洁度及平直度要求高。 8.机械搅拌发酵罐的冷却装置有哪三种？各适用于什么场合？比较其优缺点？夹套式换热装置这种装置多应用于容积较小的发酵罐、种子罐；夹套的高度比静止液面高度稍高即可，无须进行冷却面积的设计。这种装置的优点是：结

21、构简单；加工容易，罐内无冷却设备，死角少，容易进行清洁灭菌工作，有利于发酵。其缺点是：传热壁较厚，冷却水流速低，发酵时降温效果差，竖式蛇管换热装置 容积5米3以上的发酵罐多用这种换热装置。这种装置的优点是：冷却水在管内的流速大；传热系数高。这种冷却装置适用于冷却用水温度较低的地区，水的用量较少。但是气温高的地区，冷却用水温度较高，则发酵时降温困难，发酵温度经常超过40C，影响发酵产率，因此应采用冷冻盐水或冷冻水冷却，这样就增加了设备投资及生产成本。此外，弯曲位置比较容易蚀穿。竖式列管(排管)换热装置 其优点是：加工方便，适用于气温较高，水源充足的地区。这种装置的缺点是：传热系数较蛇管低，用水量

22、较大。 9.气升式发酵罐的结构及原理分为内循环和外循环两种。其主要结构包括：罐体上升管空气喷嘴10.自吸式发酵罐的工作（充气）原理自吸式发酵罐的主要的构件是自吸搅拌器及导轮，简称为转子及定子。转子由箱底向上升入的主轴带动，当转子转动时空气则由导气管吸入。转子的形式有九叶轮、六叶轮、三叶轮、十字形叶轮等，叶轮均为空心形。11.搅拌器的轴功率是指搅拌器以既定的速度旋转时，用以克服介质的阻力所需的功率，简称轴功率。12.影响搅拌器输入搅拌液体的功率的因素叶轮和罐的相对尺寸搅拌器的转速流体的性质挡板的尺寸和数目13.功率准数是一个无因次数，可定义为功率 准数NP。该准数表征着机械搅拌所施与单位体积被搅

23、拌液体的外力与单位体积被搅拌液体的惯性之比。14.根据功率准数所表征的意义推导下式式中 ：涡轮线速度a：加速度V：液体体积m：液体质量15.机械搅拌发酵罐主要由哪三个部分组成及各自的作用a) 搅拌装置：由传动装置、搅拌轴、搅拌器组成 ,由电动机和皮带传动驱动搅拌轴使搅拌器按照一定的转速旋转 ,以实现搅拌的目的。b) 轴封：为搅拌罐和搅拌轴之间的动密封 ,以封住罐内的流体不致泄漏。c) 罐体：罐体、加热装置及附件。它是盛放反应物料和提供传热量的部件。16 根据产品的年产量计算所需发酵罐的数量，并计算发酵罐的结构尺寸例如，年产5万柠檬酸的发酵厂，发酵产酸水平平均为14%，提取总收率90%，年生产日

24、期为300天，发酵周期为96小时。每日的产量=50000/300=166.7 吨每日所需发酵液的量=166.7/（0.14×0.9）=1322.8 米3假定发酵罐的装液系数为85%则每日所需发酵罐容积=1322.8/0.85=1556米3取发酵罐的公称容积为250米3则每日需要6个发酵罐发酵周期为4天，考虑放罐洗罐等辅助时间，整个周期为5天。则所需发酵罐的总数=5×6+1=31 个17，了解机械搅拌发酵罐的结构18，空气中的氧进入到细胞中要经过哪些步骤19，根据氧的传质方程，请叙述影响氧传递的因素。影响传质推动力(c*-cL)的因素:ü 温度ü 溶液的性

25、质ü 氧分压ü 发酵罐内液柱的高度影响体积氧传递系数Kla的因素:ü 搅拌ü 空气流速ü 空气分布管ü 发酵罐内液柱的高度ü 发酵液的性质ü 泡沫和消泡剂第十一章 发酵染菌的防治1， 何谓“杂菌”？在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。2， 不同染菌途径对发酵的影响 种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性 空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐 培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性 设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大 3， 染菌是如何影响产物提取和产品质量的

26、对过滤的影响：发酵液的粘度加大菌体大多自溶?由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加造成的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡大幅度降低过滤收率对提取的影响:l 有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白 质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开l 离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量对产品质量的影响:v 对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂 质。对产品的纯度有较大影响。v 对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。4.无菌试验的目的 监测培养基、发

27、酵罐及附属设备灭菌是否彻底 监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入 了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角5.杂菌的检查方法有哪几种？各种检查方法的比较？显微镜检查：染色镜检板划线检查：到平板空培养待测样品划线培养观察红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养接入样品培养观察 显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。 平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确.6.总染菌率指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比乘以100得到的百分率7.试从不

28、同染菌规模分析各自引起染菌的原因 大批发酵罐染菌 ：空气系统 部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的 个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象 个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。 8.试从染菌分析染菌的可能原因有哪几种？从染菌的规模来分析染菌原因 大批发酵罐染菌 ：空气系统 部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的 个别发酵罐连续染

29、菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象 个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。 从染菌的时间来分析 发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角 中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理从染菌的类型来分析 耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底 球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的 浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏 霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格 9.种子带菌的原因可能有哪几种 无菌室的无菌条件不符合要求 培养基灭菌不彻底 操作不当10.无菌室的基

30、本要求及其所要求的无菌程度Ø 无菌室面积不宜过大，一般约4-6米2高约2.6米。 Ø 为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1-3个套间(缓冲过道) Ø 无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形 。Ø 室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。 Ø 无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。无菌程度：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。11.造成设备泄漏可能有哪些原因?发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀磨蚀v 发酵液中固体物料因搅

31、拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起管外壁磨损v 冷却介质和加热时蒸汽的冲击，引起管内壁的磨损设备加工不良v 弯管的弯头处管壁变薄焊接不良12.盘管试漏方法有哪两种？ 气压试验 ：先在发酵罐内放满清水，用压缩空气通入管子，观察水面有无气泡产生以确定管子是否渗漏和渗漏的部位。气压法快速方便，但管子下部弯曲处积水不易排尽，有漏孔时不产生气泡就难以发现。 水压试验 ：用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐压入冷却管，泵到一定压力时，观察管子有否渗漏现象13.发酵罐管路的连接方式有哪三种，并对这三种连接方式进行比较 螺纹连接：螺纹连接简单，但装拆较麻烦，为了便于装拆， 要在管路上适当位置安装活接头(亦称“由宁”)，接头

32、平面用石棉橡胶板或橡皮等作垫圈。由于管路受冷热和震动的影响，活接头的接口易松动，使密封面不能严密而造成渗漏。如在接种输液时，因液体快速流动造成局部真空，在渗漏处将外界空气吸入、空气中的菌就被带入发酵罐中而造成危害。所以，重要的管路连接大多采用法兰连接。 法兰连接：法兰连接密封可靠，压力、温度和管径的适用范围大，但费用较高。 焊接。焊接的方法比其他方法简便，而且密封可靠。所以空气灭菌系统、培养液灭菌系统和其他物料管路以焊接连接为好。但需经常拆卸的管路则不宜用焊接连接。 14.何谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，

33、会造成连续染菌，影响生产的正常进行。15.发酵工厂的管路采用法兰连接时，如安装或操作不当有可能会形成哪些死角？Ø 法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不平现象就会造成死角；Ø 垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会造成死角。16，请问下图中的管道连接方式有何不合理之处，为什么？请画出正确的连接方式 采用种子罐时是利用压力差将种子罐中培养好的种子输入发酵罐内，种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。如下图所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以应在阀1的半截上装设旁通，？焊上一个小的放气阀，此段管路即可得到蒸汽的充分灭菌。

34、 PS：消灭死角减少挡板和开孔；焊接光滑；法兰、阀门连接正好；减少残渣沉积；严格清洗和检查。17，预防噬菌体感染的措施有哪些 发酵罐的排气管要用汽封或引入药液(如高锰酸钾、漂白粉或石灰水等溶液)槽中。 取样、洗罐或倒罐的带菌液体要处理后才允许排入下水道。 把好种子关，实现严格的无菌操作。 搞好生产场地的环境卫生。车间四周要经常进行检查，如发现噬菌体即时用药液喷洒。 18，在实际生产过程中，如何从过程检查结果分析判断染菌的原因，并提出解决的措施。从染菌的规模来分析染菌原因 大批发酵罐染菌 ：空气系统 部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路

35、系统发生问题所造成的 个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象 个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。 从染菌的时间来分析 发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角 中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理从染菌的类型来分析 耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底 球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的 浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏 霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格 解决措施：合理分析，一个个排除设备方面：l 新设备使用前空培养；

36、l 定期更换空气过滤器；l 着重注意设备内有无死角，管道阀门是否泄漏；l 缩小目标，分段排除操作方面：l 对洗罐、接种、取样等操作严格操作；定期取样 发生染菌后要对染菌发酵罐进行熏蒸或者煮罐处理，然后通过空培养？进一步确证染菌的原因。学会找交集。第十二章1， 下游加工过程的定义发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程(Down stream processing)。它由一些化学工程的单元操作组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较少。2， 发酵下游加工过程的

37、特点 培养液(或发酵液)是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和未用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。 培养液中所欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高，特别是利用基因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质蛋白质。 另一个特点是欲提取的生物物质通常很不稳定、遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解。 发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定的弹性。3， 对一具体发酵产品，在确定其下游加工工艺时应考虑哪些因素Ø 是胞内产物还是胞外产物 

38、6; 原料中产物和主要杂质浓度 Ø 产物和主要杂质的物理化学特性及差异 Ø 产品用途和质量标准 Ø 产品的市场价格 Ø 废液的处理方法等4， 发酵产品的下游加工工艺过程可分为哪四个阶段l 预处理和固液分离 ：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。l 初步分离 ：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件 l 高度纯化 ：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。l 成品制作 ：成品形式由产品的最终用途决定。 5， 发酵液凝聚和絮凝的机理电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使伦敦·范德华(L

39、ondonVander waals)吸引力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子，或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。6、 影响絮凝因素有哪些l 絮凝剂的添加量l 发酵液的pHl 絮凝剂的分子量l 搅拌转速l 搅拌时间7.在发酵工业中，常用的固液分离设备有哪几种类型ü 板框压滤机ü 鼓式真空过滤机ü 离心沉降分离机 8.错流过滤9.微生物细胞破碎的技术有哪些机械方法 球磨机 高压匀浆器 X-press法 超声波破碎 非机械方法 酶解 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 化学法10.如何选择细胞破碎的方法 细胞的数量；

40、所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性； 要达到的破碎程度及破碎所必要的速度， 尽可能采用最温和的方法； 具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。 11.盐析的定义及其机理和优缺点 在胶体溶液中加入一定量的盐溶液，会有沉淀析出的现象。原理：在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电子层，降低电位，即中性盐会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的相互碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。12.有机溶剂沉淀的原理和优缺点？优点：某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽；所得产品的纯度较高；从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便；有机溶剂本

41、身可部分的作为蛋白质的杀菌剂。缺点：需要耗用大量的溶剂，而溶剂的来源、贮存都比较困难或麻烦；沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性，收率也比盐析法低。13.等电沉淀的原理和优缺点原理：蛋白质溶液的pH等于其pI时，则溶解度最小。蛋白质等电点沉淀法就是基于不同蛋白质离子，具有不同等电点的特性，用依次改变溶液pH的方法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。优点：在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效。缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。14，吸附法的原理、优缺点，吸附的类型 吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起到分离的作用

42、。优点：可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。缺点：吸附法选择性差、收率不高。无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大。炭粉等吸附剂影响环境卫生。类型： 物理吸附：吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力)产生的吸附。 化学吸附： 化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力 范围。 交换吸附： 吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。15，影响吸附过程的因素有哪些吸附剂的性质；吸附物的性质；溶液pH的影响；温度影响；其他组分的影响。16，

43、离子交换作用，以及影响离子交换速度的因素是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里溶液称流动相，而固体称固定相。因素: 树脂颗粒的大小； 树脂的交联度； 溶液中离子浓度； 温度； 离子的大小； 离子价； 树脂强弱。17，膜分离技术的优点 适用范围广； 膜分离过程为物理过程，不需加入化学药剂； 膜分离技术分离装置简单，占地面积小，系统集成容易 ； 膜分离过程系统简单、操作容易，且易控制，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及。 18，常用的膜分离设备包括哪四种类型管式 中空纤维式 螺旋卷绕式 平板式19.

44、浓差极化、凝胶层当溶剂透过膜，而溶质留在膜上，因而使膜面浓度增大，并高于主体中浓度，这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体中，这种现象称为浓差极化。当膜面浓度增大时，通量降低。当膜面浓度增大到某一值时，溶质成最紧密排列，或析出形成凝胶层。20.膜的清洗方法有哪两种 机械方法： 化学方法21.纳滤的特点。 纳滤技术的特点：膜结构绝大多数是多层疏松结构；分离过程无任何化学反应，无需加热，无相转变，不会破坏生物活性，不会改变风味、香味。纳滤膜的特征： 一个是其截留分子量介于反渗透膜和超滤膜之间； 纳滤膜对无机盐大多是复合型膜22，反渗透23，萃取的分配定律 在恒温恒压的条件下，一种物质在两种成相的溶剂

45、（A与B，或上相与下相）的分配浓度之比是一常数，该常数称为分配系数K。24，两水相及其优点双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。通过溶质在相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。优点： 易于放大 双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速 ,因此能耗较小 , 可以实现快速分离。 易于进行连续化操作。 相分离过程温和 ,生化分子如酶不易受到破坏。 选择性高、收率高。 操作条件温和。25，超临界流体萃取的原理，其典型流程包括哪三种类型原理 临界温度(Tc) ：当气体的温度高于某一数值时，任何压缩都不能使它变为液体。 临界压

46、力（Pc）：在临界温度下，气体能被液化的最低压力。 超临界状态：当物质所处的温度高于临界温度、压力大于临界压力时 超临界流体：在临界点(指在临界温度Tc和临界压力Pc状态)附近，可以观察到一些有意义的现象：压力和温度的微小变化都会引起气体密度的很大变化。随着向超临界气体加压，气体密度增大达到液态性质，这种状态的流体称为超临界流体。其性质介于气体和液体之间。 超临界萃取：使用超临界流体作为溶剂的萃取方法，就称为超临界萃取。超临界流体的密度为气体的数百倍，而其流动性和粘度仍接近于气体，扩散系数大约为气体的1，而较液体的扩散系数大数百倍。因此，物质移动或分配时，均比其在液体溶剂中要快。将温度或压力适

47、宜变化时，可使其溶解度在1001000倍的范围内变化。 类型：等温变压法 等压变温法 吸附法第十三章1， 固定化细胞的定义、优缺点、分类固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。优点：与游离细胞相比 固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应 可以获得更高的细胞浓度； 细胞可以重复使用； 在高稀释率时，不会产生洗脱现象； 单位容积的产率高； 提高遗传稳定性； 细胞不会受到剪切效应的影响。 发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。与固定化酶相比 免去了破碎细胞提取酶的手续 酶在细胞内的稳定性较高，

48、完整细胞固定化后酶活性损失少 固定化细胞制备的成本比固定化酶低 无需辅酶再生缺点： 仅能利用胞内酶； 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用； 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性； 可能有副反应。2.细胞固定化的方法及其比较吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。3，固定化细胞反应器的优点，主要有哪些类型 固定化细胞反应器的优点在固定化细胞反应器中采用高稀释率

49、有以下优点： 生产强度、转化率高； 与恒化器相比，固定化细胞反应器具有更好的稳定性； 节省投资和能耗。 细胞再循环系统（Cell recycle systems ） 填充床反应器（Fixed bed reactors ） 流化床反应器（Fluidized bed reactors ） 絮凝细胞系统（Flocculated cell systems ）第十四章1.基因工程基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 2

50、.如何获得一个工程菌 确定目的产物。 找出产该产物的细胞。 将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。 利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。 将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。 将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。 这一过程的核心技术是DNA的重组技术。3.一个可用于工业化生产的工程菌必须符合哪些要求 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 菌株不是致病株，也不产内毒素

51、。 代谢控制容易进行。 能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。4.物理密封、生物学密封物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。 5.和天然细胞培养过程相比，工程菌的培养过程有何特点 工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为

52、低。 为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。 工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。 6.在工程菌中，质粒的不稳定性有哪两种类型 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。7.影响工程菌中质粒的稳定性的因素有哪些，如何

53、提高工程菌中质粒的 稳定性 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响 宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响8.质粒保持率 为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即 PS: 假定在分批培养过程中，细胞在对数生长期每次分裂时，其质粒丢失率为P，则Fn为？ 9.在工程菌体的培养过程中，必须防止要工程菌的外漏，从工程角度分析，在培养过程中，有哪些方面可能会造成工程菌的外漏 l 排气l 机械密封l 接种l 取样l 培养后的灭菌(通入湿热蒸气)l 排液(输至下一工序)。 第十五章1， 动植物细胞培养与微生物细胞培养有何区别 动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长； 对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳