常见的生化与分子生物学技术ppt课件

1、生物大分子的提取和纯化生物大分子的提取和纯化电泳技术电泳技术PCR技术技术核酸序列的测定核酸序列的测定蛋白质相互作用蛋白质相互作用AgrosePAGE双向电泳 杂交技术酶联免疫技术层析技术、超滤技术、膜技术层析技术、超滤技术、膜技术 检测和纯化分别生命景象生化组分分析1、构造与性质2、功能3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研讨技术方法v经典的研讨步骤：v分别生化组分细胞器和生物分子；v分析生化组分的构造；v分析生化组分的功能和代谢合成与分解及其相互作用。2022-4-193生物化学研讨技术方法l生物化学研讨技术：l分别技术：沉淀、吸附、膜分别过滤、透析等、离心、层析、电泳等；l分析检测技术：

2、电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、分子标志等。l分子生物学研讨技术：基因重组、分子杂交、PCR与反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。2022-4-194生物大分子分别纯化的普通步骤和原那么生物大分子分别纯化的普通步骤和原那么层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和超滤透析和超滤盐析硫酸铵盐析盐析硫酸铵盐析等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处置前处置 粗分级粗分级 细分级细分级 资料选择与处置资料选择与处置细胞破碎机械破细胞破碎机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶、酶解、化学处置酶解、化学处置生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品粗产品结晶结晶分子大小分子

3、大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力根据原理根据原理要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。各种物理性质：如分子的大小、穿膜的才干、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力。分别纯化的普通程序分别纯化的普通程序1、资料的选择和预处置、资料的选择和预处置 2、破碎细胞及提取有时还需求进展细胞器的分别、破碎

4、细胞及提取有时还需求进展细胞器的分别 3、分别纯化：包括粗分级分别和细分级分别、分别纯化：包括粗分级分别和细分级分别其中前两个阶段为生物大分子分别纯化的前处置。其中前两个阶段为生物大分子分别纯化的前处置。生物大分子的浓缩p沉淀法沉淀法:在提取液中参与适量的中性盐或有机溶剂，在提取液中参与适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤搜集的沉使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤搜集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液经过透析或凝胶过滤脱盐。获得的上清液经过透析或凝胶过滤脱盐。p盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀

5、法；非离子盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等法；酸碱变性沉淀法等 。 p 吸附法：将干葡聚糖凝胶参与提取液中，由于凝胶吸附法：将干葡聚糖凝胶参与提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可减少三倍左右。吸水，提取液的体积可减少三倍左右。p 超越滤法：把提取液装入过滤安装，在空气或氮气的压力下，使小分子物质经过半透膜，大分子物质留在膜内。p 透析浓缩法p 减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏安装中，在减压真空形状下进展蒸馏。p 冰冻枯燥法纯度鉴定纯度鉴定l生物大分子经过分别提纯，最后还

6、要鉴定制品的纯生物大分子经过分别提纯，最后还要鉴定制品的纯度。度。l蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。心沉降分析法等。l纯的蛋白质在一定条件下进展电泳，将以单一的速纯的蛋白质在一定条件下进展电泳，将以单一的速度挪动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋度挪动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度挪动。白质在离心场中，应以单一的沉降速度挪动。l选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质选用任何单独

7、一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必需同时采用的纯度，必需同时采用2-32-3种不同的方法才干确定。种不同的方法才干确定。蛋白质、核酸的定性定量检测蛋白质、核酸的定性定量检测1、蛋白质的测定、蛋白质的测定 凯氏定氮法含凯氏定氮法含N量量 6. 25 双缩脲法、双缩脲法、Folin-酚法酚法 紫外光度法紫外光度法l lmax=280nm 离心法、电泳法、层析法离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定、酶活力的测定 终点法、动力学法终点法、动力学法3、氨基酸的测定、氨基酸的测定 茚三酮法茚三酮法 Sangerf法、法、Edmam法、法、DNS法法4、核酸的测定、核酸的测定 紫外光度法紫外光度法

8、l lmax=260nm 分子杂交法分子杂交法 离心法、电泳法离心法、电泳法l核酸的纯度鉴定普通采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰核酸的纯度鉴定普通采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法A260/A280A260/A280等方法。等方法。l同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必需采用同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必需采用2-32-3种方种方法才干确定。法才干确定。电泳根本原理l电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于所带电荷及颗粒大小外形等不同，因此向相反电极所带电荷及颗粒大小外形等不同，因此向相反电极泳动速度不同进

9、而到达分别目的一种方法。泳动速度不同进而到达分别目的一种方法。l在一定在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷条件下，每一种分子都具有特定的电荷种类和数量、大小和外形，在一定时间内它们种类和数量、大小和外形，在一定时间内它们在一样电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位在一样电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而构成严密的泳动带。这就是带电粒子可以用置上而构成严密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进展分别、分析和鉴定的根本原理。电泳技术进展分别、分析和鉴定的根本原理。电泳带电粒子或分子的大小、外形、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分别样品中各种分子带电性质以及分子本身大

10、小、外形等存在的差别，使得带电分子的“泳动速度不同，因此可以利用电泳技术对生物分子进展分别、鉴定或纯化。电泳技术有多种方式，但普通根据有无支持物将其分为无支持物的自在电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶为支持物的凝胶电泳。等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。l影响泳动度的要素：影响泳动度的要素：l1. 电场强度：电场强度：l电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度电势梯度)。电场强度越高，那么带电颗粒泳

11、动越快。电场强度越高，那么带电颗粒泳动越快。l2. 溶液溶液pHl为使电泳时为使电泳时pH值恒定，必需采用缓冲液作为电极液，溶液值恒定，必需采用缓冲液作为电极液，溶液的的pH值决议带电颗粒的解离程度，亦即决议其所带电荷的值决议带电颗粒的解离程度，亦即决议其所带电荷的多少。多少。l3.离子强度离子强度Il 溶液的溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分别度却较越高，质点的泳动速度越慢，但区带分别度却较明晰。明晰。4. 电渗电渗电泳缓冲液相对于固体支持物的挪动称电渗。如纸电泳电泳缓冲液相对于固体支持物的挪动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液离子带负电荷

12、，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极挪动，会对颗粒的挪动呵斥不良影响，带正电荷向负极挪动，会对颗粒的挪动呵斥不良影响，故电泳时，电渗小些为好故电泳时，电渗小些为好5. 温度温度 电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率添加，同时温度过高会使样品中的生物大快，迁移率添加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热安装。可安装冷却散热安装。6.支持物支持物现代电泳多在固体支持物上进展，使样品中的不同组分现代电泳多在固体支持物上进展，使样品中的不同组

13、分构成不同的区带，称区带电泳。电泳终了后，支持物构成不同的区带，称区带电泳。电泳终了后，支持物可以方便地进展染色等后续处置。可以方便地进展染色等后续处置。电泳技术分类|按电泳的原理来分，可分为四种：|区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分别成独立的区带，这是当前运用最广泛的电泳技术。|移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U 形管中进展的，由于分别效果较差，已为其他电泳技术所取代。|等速电泳：需公用电泳仪，当电泳到达平衡后，各组分的区带相随并构成明晰的界面，并以等速挪动。|等电聚焦：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动构成pH梯度，使被分别物挪动至各自等电

14、点pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。外表看与区带电泳类似，但原理不同DNA的琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳对核酸的分别作用主要根据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有亲密关系。核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系DNA分子的大小：在凝胶中，DNA片段迁移间隔(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此经过知大小的规范物挪动的间隔与未知片段的挪动间隔进展比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超越20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，运用琼脂糖凝胶电泳分别DNA时，分子大小不宜超越此值。琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需求用不同浓度的琼

15、脂糖凝胶进展电泳分别。 2. 琼脂糖凝胶电泳l核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分别的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分别的关系l不同构型不同构型DNADNA的挪动速度次序为：的挪动速度次序为：l共价闭环共价闭环DNADNAcccDNAcccDNA直线直线DNADNA开环的双链环开环的双链环状状DNADNAl当琼脂糖浓度太高时，环状当琼脂糖浓度太高时，环状DNADNA普通为球形不普通为球形不能进入胶中，相对迁移率为能进入胶中，相对迁移率为0 0Rf = 0Rf = 0，而同等，而同等大小的直线双链大小的直线双链DNA(DNA(刚性棒状刚性棒状) )那么可以长轴方向那么可以长轴方向前进前进RfRf0 0，l由

16、此可见，这由此可见，这3 3种构型的相对迁移率主要取决于凝种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也遭到电流强度、缓冲液离子强胶浓度，但同时，也遭到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。度等的影响。 聚丙烯酰胺凝胶电泳l聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺简聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺简称称Acr和交联剂和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺简称简称Bis在加速剂和催化剂的作用下在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状构造的凝胶，以此聚合并联成三维网状构造的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称胶电泳简称PAGE。l聚丙烯酰胺凝胶有以下优

17、点：聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：l在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。能好。l化学性能稳定，与被分别物不发生化学反响。化学性能稳定，与被分别物不发生化学反响。l对对pH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。l几乎无电渗作用，只需几乎无电渗作用，只需Acr纯度高，操作条纯度高，操作条件一致，那么样品分别反复性好。件一致，那么样品分别反复性好。l样品不易分散，且用量少，其灵敏度可达样品不易分散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。l凝胶孔径可经过选择单体及交联剂的浓度调凝胶孔径可经过选择单体及交联剂的浓度调理。理。l分辨率高，尤其在不延续凝胶电泳中，集浓分辨

18、率高，尤其在不延续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因此较醋酸缩、分子筛和电荷效应为一体，因此较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。率。l聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：l分别范围不同分别范围不同l 琼脂糖凝胶电泳分别分子量比较大的物质，琼脂糖凝胶电泳分别分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分别分子量较尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分别分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。小的物质，如蛋白质，氨基酸等。l凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同l琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前琼脂糖凝胶

19、在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否那么会影响凝胶孔径的大小。要求，否那么会影响凝胶孔径的大小。l凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同l琼脂糖凝胶最薄只能到达；聚丙烯酰琼脂糖凝胶最薄只能到达；聚丙烯酰胺凝胶可以制成胺凝胶可以制成.，分辨率高。，分辨率高。l本钱不同。本钱不同。l琼脂糖价钱廉价；聚丙烯酰胺凝胶价钱较高琼脂糖价钱廉价；聚丙烯酰胺凝胶价钱较高l平安性不同。平安性不同。l琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性l

20、凝胶聚合的原理及有关特性凝胶聚合的原理及有关特性l催化系统常用有两种：催化系统常用有两种：l过硫酸氨过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统化学催化聚合系统l此系统中，四甲基乙二胺此系统中，四甲基乙二胺TEMED称为加速剂，称为加速剂，它能以自在基的方式存在。微量的它能以自在基的方式存在。微量的TEMED的参与，的参与，可使过硫酸氨可使过硫酸氨APS，引发剂构成自在基。这，引发剂构成自在基。这些自在基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯些自在基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反响，构成具有一定孔径的聚丙烯酰酰胺的交联反响，构成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。胺凝胶。l核黄素核黄素TEMED光

21、聚合催化系统光聚合催化系统l此系统中，核黄素经紫外线光解构成无色基，再此系统中，核黄素经紫外线光解构成无色基，再被痕量氧氧化构成自在基，引发聚合反响。被痕量氧氧化构成自在基，引发聚合反响。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。用用于大孔浓缩胶的配置。凝胶聚合的原理及有关特性影响凝胶聚合的要素AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可短少的试剂，AP应在枯燥、避光的条件下保管，其水溶液应置棕色瓶中，4冰箱储存，普通仅能存放一周。TEMED液状应密闭贮于4冰箱中。添加AP和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳

22、时烧胶和谱带变形。应选择适宜的配方使聚合在40-60min内完成。pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5)聚合凝胶会变得脆 而混浊，普通25-35聚合较好。氧分子：氧分子妨碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂。 PAGE原理PAGE据其有无浓缩效应，分为延续系统与不延续系统两大类。延续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不延续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度

23、的不延续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分别效果更好。不延续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不延续性、缓冲液离子的不延续性、PH的不延续性及电位梯度的不延续性，使样品在不延续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进展分别。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓变性凝胶，即在凝胶中参与变性剂，如尿素、所谓变性凝胶，即在凝胶中参与变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。这些等。这些变性剂可以破坏或改动蛋白质的构造，把绝大部变性剂可以破坏或改动蛋白质的构

24、造，把绝大部分蛋白质分别成组成它们的亚基。同时在蛋白质分蛋白质分别成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷根本上掩分子周围包围了大量负电荷。这种电荷根本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。由于由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超越了天然蛋白质原有的负电所带的负电荷大大超越了天然蛋白质原有的负电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差别，使蛋白质均带有一样密度的负电荷，荷的差别，使蛋白质均带有一样密度的负电荷，因此可

25、利用因此可利用Mr差别将各种蛋白质分开。在蛋白质差别将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，参与溶解液中，参与SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键复原，使多肽分成单个亚单白质分子中的二硫键复原，使多肽分成单个亚单位。位。膜分别根本技术 膜分别与常规的分别技术相比 具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优点 特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分别。2022-4-1927膜纵切面方式图膜纵切面方式图以分别运用领域过程分类微滤(micro-filtration, MF)超滤(untra-filtration, UF)反浸透(reverse osmos

26、is, RO)透析(Dialysis, DS)电透析(electro-dialysis, ED)纳米膜分别(NF)亲和过滤(affinity filtration, AF)浸透气化(pervaporation, PV 膜分别根本技术 膜分别过程的推进力是静压差、浓度差或者电位差，膜分别过程的推进力是静压差、浓度差或者电位差，有的分别过程能够是几种推进力都兼而有之。有的分别过程能够是几种推进力都兼而有之。 膜在分别过程中有三种功能：膜在分别过程中有三种功能： 物质的识别与透过，这是使混合物各组分之间实现物质的识别与透过，这是使混合物各组分之间实现分别的内在要素分别的内在要素 界面作用，以膜为界面

27、将透过液和保管液分为互不界面作用，以膜为界面将透过液和保管液分为互不混合的两相混合的两相 反响场作用，膜外表及孔内外表含有与特性溶质有反响场作用，膜外表及孔内外表含有与特性溶质有相互作用才干的官能团，经过物理作用、化学反响相互作用才干的官能团，经过物理作用、化学反响或生化反响提高膜分别的选择性和分别速度。或生化反响提高膜分别的选择性和分别速度。2022-4-19生命科学学院生命科学学院292022-4-1929生命科学学院生命科学学院 分别膜 分别膜应具备的根本条件为：好的选择透过性；良好的分别性能即截留率高，透过率大；理化性能良好；污染小，运用寿命长；价廉易得。 各种分别膜按所运用的材质不同

28、可分为无机资料膜和有机资料膜。 无机资料膜有陶瓷膜和不锈钢膜， 有机膜多为合成高分子资料膜，主要有纤维素类、聚矾类、聚烯烃类、聚酞胺类和芳香杂环类等。2022-4-19生命科学学院生命科学学院302022-4-1930生命科学学院生命科学学院膜分别根本技术 分别膜 分别膜的性能参数主要有：孔道特征、浸透通量、截留率和截留相对分子质量等。 孔道特征包括 孔径大小，孔径大小用最大孔径和平均孔径来描画 孔径分布，孔径分布指各种孔径的孔占全部孔的体积分数。 孔隙率，孔隙率是指孔体积占膜总体积的百分数。2022-4-19生命科学学院生命科学学院312022-4-1931生命科学学院生命科学学院透析和超滤

29、透析和超滤 J透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜，但小分子物质和离子可以经过而进展纯化的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子溶液中的小分子物质。J超滤 对透析原理进展了改良，它利器具有一定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压条件下对生物大分子溶液进展过滤，使大分子保管在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而到达脱盐、浓缩或改换缓冲液的目的。透析方法表示图透析方法表示图沉淀与离心沉淀与离心J 沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它们进展选择性沉淀从而到达分别目的的一种粗纯化方法。它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中沉淀出来。这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之

30、效。J 实现选择性沉淀的方法有改动pH 或改动离子强度或者参与特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉淀物都需求借助于离心的手段与上清分开。J 离心方法是根据分子的特征密度来分别大分子。假设一种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有能够经过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作用下经过溶液发生沉降。J 差速离心和密度梯度离心 离心机的运用 高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，运用不高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，运用不当或缺乏定期的检修和保养，都能够发生严重事故，因此当或缺乏定期的检修和保养，都能够发生严重事故，

31、因此运用离心机时都必需严厉遵守操作规程：运用离心机时都必需严厉遵守操作规程： 运用各种离心机时，必需事先在天平上精细地平衡离心管运用各种离心机时，必需事先在天平上精细地平衡离心管和其内容物，平衡时分量之差不得超越各离心机阐明书所和其内容物，平衡时分量之差不得超越各离心机阐明书所规定的范围。规定的范围。 装载溶液时，要根据各种离心机的详细操作阐明进展，根装载溶液时，要根据各种离心机的详细操作阐明进展，根据待离心液体的性质及体积选用适宜的离心管，严禁运用据待离心液体的性质及体积选用适宜的离心管，严禁运用显著变形、损伤或老化的离心管。显著变形、损伤或老化的离心管。 每次运用后，必需仔细检查转头，及时

32、清洗、擦干，转头每次运用后，必需仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点维护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，是离心机中须重点维护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，防止呵斥伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊维防止呵斥伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊维护。护。2022-4-19南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院37 层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的外形和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度挪动，而到达分别的技术。 层析技术操作简便，样品可多

33、可少，既可用于实验室的研讨任务，又可用于工业消费， 还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。 层析层析 层析法又被称为色谱。一切的层析系统都由两相组成：一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的流动相，如水和各种溶剂。 当待分别样品随着流动相经过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用如吸附、溶解或结合等的才干不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且随着流动相向前挪动，各组份会不断地在两相中进展再分配。 与固定相互相作用力越弱的组份，随流动相挪动时遭到的阻力就越小，向前挪动的速度越快；反之，与固定相互相作用越强的组

34、份，向前挪动速度越慢。经过分部搜集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而到达分别各组份的目的。表表1 1 主要的层析方法及其原理主要的层析方法及其原理名称分离原理吸附层析各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同分配层析各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同离子交换层析固定相是离子交换树脂，各组份因所带电荷状况不同与离子交换树脂的亲和力不同凝胶层析固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞的程度不同疏水层析固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂的结合能力不同亲和层析固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组份

35、分离的目的层析根本操作过程层析根本操作过程 安装选择安装选择上样和洗脱上样和洗脱结果检测结果检测 上样均一性 洗脱安装目的不同目的不同 检测方法不同检测方法不同活性检测活性检测基质均匀性基质均匀性柱层析的柱层析的L/dL/d比值比值洗脱安装洗脱安装v 不改动溶剂体系v 依托液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱v缺陷：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。v改善：蠕动泵或恒流泵 改动溶剂系统改动溶剂系统 分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺陷：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改动又不能够过细过密同一个洗脱级分中就能够含有两种或两种以上的蛋白

36、质，达不到分别纯化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析 改动溶剂系统改动溶剂系统 梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度延续地进入处于温暖搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式延续地发生改动。留意：梯度洗脱呈现一个峰，但有能够存在两个性质接近的蛋白质。 性能未知样品的蛋白质分别： 改动缓慢的梯度洗脱假设为单峰：分级洗脱离子交换层析离子交换层析原原 理理l离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为挪动相，分别和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多

37、糖等的一项技术。 l原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而到达分别纯化的目的。选择离子交换剂的普通原那么：选择离子交换剂的普通原那么：根据所带的电荷性质。如带正电荷，应选根据所带的电荷性质。如带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如为两性离子，根据其在稳离子交换剂；如为两性离子，根据其在稳定定pHpH范围内所带电荷的性质选择。范围内所带电荷的性质选择。在分别生命大分子物质时，选用亲水性基在分别生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为适宜，它们对被分别物质质的交换剂较为适宜，它们对被分别物质的吸附和洗脱都比较温暖，活

38、性不易破坏。的吸附和洗脱都比较温暖，活性不易破坏。 离子交换树脂的处置，再生等概念 离子交换层析技术的运用离子交换树脂分别氨基酸离子交换树脂分别氨基酸分子筛表示图分子筛表示图亲和层析表示图亲和层析表示图亲和层析亲和层析 亲和层析是利用生物分子间所具有的专亲和层析是利用生物分子间所具有的专注而又可逆的亲和力而使生物分子分别纯化注而又可逆的亲和力而使生物分子分别纯化的层析技术。的层析技术。 具有专注而又可逆的亲和力的生物分子具有专注而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与

39、抗体、DNADNA和和RNARNA、激素和其受体、激素和其受体、DNADNA与结合蛋白等。与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进展亲和层析，到达分别纯化目的。例如，子进展亲和层析，到达分别纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分别纯化，也可把酶固定相，使样品中的酶分别纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分别纯化。作为固定相，使样品中的辅酶分别纯化。 配基与偶联凝胶的选择与处置配基与偶联凝胶的选

40、择与处置 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必需偶联于不溶性母体。配基必需偶联于不溶性母体(matrix) (又称又称载体或担体载体或担体)上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。 当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常在体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常在载体和配基之间接入不同长度的衔接臂载体和配基之间接入不同长度的衔接臂(spac

41、e arm)。 偶联时，必需首先使载体活化。即经过某种方法偶联时，必需首先使载体活化。即经过某种方法(如溴化氰法、叠氮法等如溴化氰法、叠氮法等)为载体引入某一活泼的基为载体引入某一活泼的基团。团。 亲和层析的操作条件亲和层析的操作条件 亲和柱层析装柱方法与凝胶层析一样，层析操亲和柱层析装柱方法与凝胶层析一样，层析操作与离子交换层析类似。但由于亲和层析的对象作与离子交换层析类似。但由于亲和层析的对象都是生物分子，为防止生物大分子变性，常在低都是生物分子，为防止生物大分子变性，常在低温温(4)下进展。亲和层析柱所用的平衡缓冲液应下进展。亲和层析柱所用的平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，与样品缓冲液一致

42、，pH普通在近乎中性的范围内。普通在近乎中性的范围内。上柱时流速应尽能够缓慢。上柱后，用大量平衡上柱时流速应尽能够缓慢。上柱后，用大量平衡缓冲液洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗缓冲液洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱终了后，继续用洗脱液洗涤，直至无亲和物为脱终了后，继续用洗脱液洗涤，直至无亲和物为止。最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可止。最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可反复运用。暂时不用时，亲和层析柱应置于反复运用。暂时不用时，亲和层析柱应置于4低低温保管。温保管。 蛋白质研讨方法蛋白质研讨方法假定他发现一种新的蛋白质：蛋白质假定他发现一种新的蛋白质：蛋白质X X1. 1.

43、如何得到这种蛋白质如何得到这种蛋白质? ? 蛋白质的分别、纯化技术蛋白质的分别、纯化技术2. 2. 这种蛋白质的大小？这种蛋白质的大小？ SDS-PAGESDS-PAGE3.3.它的它的pIpI是多少？是多少？ 等电聚焦等电聚焦4. 4. 其他细胞或其他生物体内能否存在？其他细胞或其他生物体内能否存在？ WesternWestern印迹印迹5. 5. 其一级构造如何？其一级构造如何？ 序列分析序列分析6.6.其三维构造又如何？其三维构造又如何？ X- X-射线衍射和核磁共振射线衍射和核磁共振蛋白质纯化蛋白质纯化一、预备任务：要处理三个问题：1纯化蛋白质的目的；2目的蛋白的测活方法；3纯化蛋白质

44、的原料。二、纯化步骤：1破碎细胞或组织混合和匀浆；2去除残渣离心；3沉淀/浓缩硫酸铵或聚乙二醇；4纯化层析；5鉴定蛋白质和酶纯化的常见方法和方案设计分别纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性质，例如溶解性、质量和外形、外表电荷、外表疏水性、与特定配体结合的性质等。常用的方法有：沉淀溶解性； 离子交换电荷；聚焦层析电荷；凝胶过滤大小和外形；疏水作用层析疏水性；亲和层析与特定配体的特异性结合。蛋白质纯化的预备任务。在进展蛋白质纯化之前首先要处理三个问题：1纯化蛋白质的目的；2目的蛋白的测活方法；3纯化蛋白质的原料。一个典型的蛋白质纯化方案开场于完好的组织，普通经过四个阶段：1破碎细胞或组织混合

45、和匀浆；2去除残渣离心；3沉淀/浓缩硫酸铵或聚乙二醇；4纯化层析；4鉴定，包括纯度、大小或pI的测定。蛋白质纯度的鉴定1电泳法：如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细管电泳等，纯真的蛋白质电泳的结果应该是一条带。假设运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，那么应该特别小心，由于SDS可以破坏蛋白质的四级构造，假设一种蛋白质由不同的亚基组成，那么会出现几条带。此外，电泳法检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两侧的两个不同的pH 值分别进展检测，这样得出的结论才更可靠；2化学法：N-端测定，C-端测定。纯品蛋白质应该具有恒定的N-端或C-端组成。假设一种蛋白质只需一条链组成，那么只会检测到一种N-端或

46、C-端氨基酸；3仪器法：HPLC或质谱。假设一种蛋白质样品在HPLC上只表现单一的峰，那么可视为其为纯品；假设纯化的是一种知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量与实践的值一致，那么也可以为它是纯品。 等电聚焦需求在凝胶中参与两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自挪动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是经过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分别，而且还可以测定出各种蛋白质的pI蛋白质一级构造的测定蛋白质一级构造的测定 直接测定法 间接测定法： 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决议的

47、氨基酸序列。WesternWestern印迹印迹蛋白质组研讨的根本技术道路蛋白质组研讨的根本技术道路蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或知蛋白新的或知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳双向凝胶电泳双向凝胶电泳2 2DEDE原理原理: : 先根据蛋白质的等电点不同在先根据蛋白质的等电点不同在pHpH梯度介质中进展第一次分别，梯度介质中进展

48、第一次分别，即等电聚焦即等电聚焦isoelectric focusing, isoelectric focusing, IEFIEF，然后根据蛋白质分子量的，然后根据蛋白质分子量的不同进展第二次分别，即不同进展第二次分别，即SDS-SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳完好的实验步骤包括：完好的实验步骤包括： 样品分别、等电聚焦、平衡、样品分别、等电聚焦、平衡、第二向分别、第二向分别、 染色、成像、软件分析、蛋白染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定质鉴定 1.样品制备样品制备样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研讨目的来决样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研讨目的来决议详细的实验方

49、法。议详细的实验方法。蛋白样品的有效溶解是胜利分别蛋白质的最关键的要素之一。蛋白样品的有效溶解是胜利分别蛋白质的最关键的要素之一。可以根据样品性质的不同，选器具有单一的增溶作用的溶可以根据样品性质的不同，选器具有单一的增溶作用的溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、复原剂的复杂混合溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、复原剂的复杂混合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体完全液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体完全破坏。破坏。分子杂交技术分子杂交技术 分子生物学中用于检测生物样本中能否含有特定的分子生物学中用于检测生物样本中能否含有特定的生物分子的一门技术。生物分子的一门技术。样

50、品 制 备电 泳杂 交转 膜结果显示探探 针针 制制 备备分分 子子 杂杂 交交 原原 理理 及及 流流 程程 图图表表2 各种印迹技术各种印迹技术印迹类型 转移到膜上的分子探针获得的信息Southern DNA片段 放射性标记的互补RNA或DNA 基因结构等 Northern RNA放射性标记的互补RNA或DNA特定RNA的大小、分布和含量Western 蛋白质 一级抗体和与酶偶联的二级抗体 特定蛋白质的大小、分布和含量核酸分子杂交的根本原理核酸分子杂交的根本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原那么退火构成双链的过程。按碱基

51、互补配对原那么退火构成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和知核酸序列，知杂交的双方是待测核酸和知核酸序列，知 核酸序列称探针。核酸序列称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。杂交有固一液相杂交和液相杂交。 影响杂交的要素影响杂交的要素 1、核酸分子的浓度和长度：、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度添加，杂交效率添加单链探针，浓度添加，杂交效率添加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影浓度过高影响杂响杂 交效率交效率2、温度：、温度： 1DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交

52、，适宜温度较Tm值低值低2025 2RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低杂交，加甲酰胺降低 Tm值值 3用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5 3、离子强度：、离子强度： 1低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度添加，杂低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度添加，杂交率添加交率添加 2高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进展序列不完全同源的核酸分子杂交时，必需维持杂交展序列不完全同源的核酸分子杂交时，必需维持杂交反响液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度反响液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4、甲酰胺：、甲酰胺： 1

53、甲酰胺能降低核酸杂交的甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 杂交杂交 2如待测核酸序列与探针同源性高时，那么用水如待测核酸序列与探针同源性高时，那么用水溶液在溶液在68杂交杂交 5、核酸分子的复杂性：、核酸分子的复杂性： 1核酸的复杂性是指存在于反响体系中不同顺序核酸的复杂性是指存在于反响体系中不同顺序的总长度的总长度 2Cot与反响体系中核酸复杂性成正比与反响体系中核酸复杂性成正比 3两个两

54、个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于杂交率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性 6、非特异性杂交反响：、非特异性杂交反响： 1杂交前封锁非特异性杂交位点，减少其对探针杂交前封锁非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附的非特异性吸附 2常用的封锁物有两类：即非特异性常用的封锁物有两类：即非特异性DNA和高分和高分子化合物。如鲑精子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉溶液或脱脂奶粉 一个理想的标志物应满足：(1)标志前后探针根本构造、化学性质一样;(2)特异性强、本底低、反复性好；(3)操作简单、节时；(

55、4)平安、无环境污染。Northern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性形状，处于变性形状，DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中不变性中不变性 2、转膜：、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处置转膜前不需变性和中和处置,Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进展碱变性及中和处置转膜前需进展碱变性及中和处置 3、靶核酸为、靶核酸为RNA探针的标志探针的标志一、探针的种类一、探针的种类 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核

56、苷酸探针核酸分子杂交实验要素的优化核酸分子杂交实验要素的优化|探针的选择探针的选择| 在大多数情况下，可以选择克隆的在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或或cDNA双链探针双链探针|在检测单链靶序列时应选用与其互补的在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链单链探针或探针或RNA探针探针 |长的双链长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交交 p探针的标志方法探针的标志方法p 选择什么标志方法主要视个人的习惯和可利用条件选择什么标志方法主要视个人的习惯和可利用条件而定；而定；

57、p 但还应思索实验的要求，如灵敏度和显示方法等但还应思索实验的要求，如灵敏度和显示方法等p p 普通以为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高普通以为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高p 在对灵敏要求不高时，可采用保管时间长的生物素在对灵敏要求不高时，可采用保管时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统 五、核酸分子杂交实验要素的五、核酸分子杂交实验要素的优化优化p探针的浓度探针的浓度p总的来说，随探针浓度添加，杂交率也添加总的来说，随探针浓度添加，杂交率也添加p在较窄的范围内，随探针浓度添加，敏感性添加在较窄的范围内，随探针浓度添加，敏感性添加p膜

58、杂交中膜杂交中32P标志探针与非放射性标志探针的用量分别标志探针与非放射性标志探针的用量分别为为510ng/ml和和251000ng/ml，而原位杂交中，无，而原位杂交中，无论运用何种标志探针，其用量均为论运用何种标志探针，其用量均为0.55.0g/mlp p受不同类型标志物的固相支持物的非特异结合特性的影受不同类型标志物的固相支持物的非特异结合特性的影响响 五、核酸分子杂交实验要素的优五、核酸分子杂交实验要素的优化化p杂交率杂交率 p现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进展在探针过剩的条件下进展 p在探针过量的条件下，杂交率主要依

59、赖于探针在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度复杂度和探针浓度。长度复杂度和探针浓度。p下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形杂交的情形 p t1/2=ln2/kcpt1/2半数探针与固定靶序列杂交所需的时间半数探针与固定靶序列杂交所需的时间spk =构成杂交体的速率常数构成杂交体的速率常数mol/(Lxntxs)决议决议于探针长度于探针长度L、探针复杂度、探针复杂度N、温度、温度、离子强度、粘度和离子强度、粘度和pHpc =溶液中的探针浓度溶液中的探针浓度mol/L五、核酸分子杂交实验要素的五、核酸分子杂交实验要素的优化优化 杂交最适

60、温度杂交最适温度 杂交技术最重要的要素之一杂交技术最重要的要素之一 反响温度低于反响温度低于Tm 1015，碱基顺序高度同源的，碱基顺序高度同源的互补链可构成稳定的双链，错配对减少。假设反响温互补链可构成稳定的双链，错配对减少。假设反响温度再低度再低Tm-30，虽然互补链之间也可构成稳定，虽然互补链之间也可构成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱合的更弱 最适复性温度最适复性温度Optimunm renaturation temperature, TOR：Tor =Tm 25 苛刻复性温度：苛刻复性温度：Ts = Tm (10