第一章基因工程的分子生物学基础

1、第一章基因工程的分子生物学基础基因工程的概念l细胞外用各种方法产生的核酸分子插入载细胞外用各种方法产生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。生物中，并进行复制繁衍。l遗传工程、基因操作、重组遗传工程、基因操作、重组DNA技术等技术等基因工程诞生的理论基础 -证明了证明了DNA是遗传物质是遗传物质 -双螺旋模型双螺旋模型 - 遗传密码子的破译遗传密码子的破译1）不同的基因具有相同的物质基础）不同的基因具有相同的物质基础2）基因是可切割的）基因是可切割的

2、3）基因是可以转移的）基因是可以转移的4）多肽与基因之间存在对应关系）多肽与基因之间存在对应关系5）遗传密码是通用的）遗传密码是通用的6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。基因工程的技术基础l工具酶：工具酶：DNA连接酶连接酶 内切酶内切酶 反转录酶反转录酶lPCR技术技术l载体技术载体技术l基因转移技术基因转移技术第三节第三节 基因工程中采用的主要酶类基因工程中采用的主要酶类一、序列特异的一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 噬菌体噬菌体E.coli菌株菌株K KC CB B K 110-410-4 C10-4110-4B 11

3、 1（一）限制性内切酶的发现（一）限制性内切酶的发现 宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用1 、宿主细胞的限制和修饰作用：、宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入两种不同来源的入-噬菌体噬菌体K； C，能高频感染各自，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（大肠杆菌宿主细胞（ K株，株，C 株株 ）。）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但千倍。一但K 噬菌体在噬菌体在C株成功，由株成功，由C株繁殖出株繁殖出K后代，能感染后代，能感染C株株, 不能感染原来不能感染原来K株株.(二二 )限制和修饰作用的分子机制限制和修

4、饰作用的分子机制1大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 K株，株，C株株 ，有各自的限制和修饰系统。，有各自的限制和修饰系统。 1） 它们均有三个连续的基因位点控制，它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2） hsdR编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶-识别识别DNA分子特定位点，分子特定位点，将双链将双链DNA切断。切断。 3） hsdM编码产物是编码产物是DNA甲基化酶甲基化酶-催化催化DNA分子特定位点的分子特定位点的碱基甲基化反应。碱基甲基化反应。 4） hsdS表达产物的功能是表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，协助限制性核酸内切酶和甲基

5、化酶，识别特殊的作用位点。识别特殊的作用位点。(二二)、限制和修饰作用的分子机制、限制和修饰作用的分子机制 2. 入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，株，C株株 中，中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体和噬菌体DNA特异特异性保护性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点（修饰）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点（修饰） 3当外来当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解（限入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解（限制）制） 4. 由于降解不完全，外来少数由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主

6、细胞中繁殖过分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但一但K噬菌体在噬菌体在C株成功，由株成功，由C株繁殖出株繁殖出K 后代，能感染后代，能感染C株株, 不能感染原来不能感染原来 K株株) 6细菌利用限制和修饰系统来区分自身细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来与外来DNA。 B株不能产生限制性内切酶，其它来源入株不能

7、产生限制性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染噬菌体可以感染B株，在株，在B株株繁殖，入繁殖，入-噬菌体则在噬菌体则在 K株和株和 C株株 受到严格的限制作用受到严格的限制作用(二二) 限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制(三三) 限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类I类酶类酶II类酶类酶III类酶类酶酶分子酶分子三亚基双功能三亚基双功能内切酶与甲基化酶内切酶与甲基化酶分离分离二亚基双功能二亚基双功能识别位点识别位点二分非对称序列二分非对称序列4-8bp序列，回文序列，回文结构结构5-7bp非对称序列非对称序列切割位点切割位点距识别位点距识别位点1000bp在识别位点中或靠在识别位点

8、中或靠识别位点识别位点在识别位点在识别位点 下游下游24-26bp限制性反应与限制性反应与甲基化反应甲基化反应互斥互斥分开反应分开反应同时竟争同时竟争限制作用限制作用需要需要需要需要不需要不需要（四）限制性内切酶（四）限制性内切酶切割特点切割特点1、识别位点、识别位点一般为一般为4-8个个bp的回文序列的回文序列大多数酶作用于底物大多数酶作用于底物DNA双链，双链，位点在识别序列中或靠近识位点在识别序列中或靠近识别序列别序列少数酶能作用于回文序列相少数酶能作用于回文序列相应应DNA单链序列单链序列（四）限制性内切酶（四）限制性内切酶切割特点切割特点l平末端：平末端： 两条链上的断裂位置是处在一

9、个对称两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的结构的中心，形成的DNA片段具有平末端。片段具有平末端。l黏性末端：指黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。过互补碱基间的配对而重新环化起来。 5突出的黏性末端突出的黏性末端 3 突出的黏性末端突出的黏性末端平末端的平末端的DNA片段不易重新环化片段不易重新环化已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：5-P 端突出：端突出：3-OH 端突出：端突出：同

10、尾酶同尾酶l一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。端的核酸内切限制酶。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5同裂酶（isoschizomers） 有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。l限制酶识别与切割的靶点序列及其随后限制酶识别与切割的靶点序列及其随后的连接同的连接同DNA的来源无关，即不带有种的来源无关，即不带有种的特异性

11、，对各种的特异性，对各种DNA普遍适用普遍适用 。l根据这一特性，才能将不同来源的根据这一特性，才能将不同来源的DNA片段重组成新的重组体分子或是新的基片段重组成新的重组体分子或是新的基因。因。从生物秀网站下载二、连接酶二、连接酶（一）（一）DNA连接酶的作用模式连接酶的作用模式1、连接酶：能够催化两条双链、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成链之间形成5，3磷酸二磷酸二酯键的酶酯键的酶5末端形成末端形成DNA腺苷酸腺苷酸复合物复合物（二）（二） DNA连接酶的两种类型连接酶的两种类型类型类型 I：E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端）连接酶（只连接粘末端）利用利用NAD（烟酰胺腺

12、嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物于原核生物类型类型 II：T4 DNA连接酶（粘末端和平末端）连接酶（粘末端和平末端）利用利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也噬菌体也属于此类属于此类在基因工程的实验中主要用在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶连接酶（三）（三） 条件条件（1）连接所需的条件）连接所需的条件一条一条DNA链的链的3末端具有一个游离的羟基（末端具有一个游离的羟基（-OH），而在另一条），而在另一条DNA链的链的5末端末端具有一个磷酸基团（具有一个磷酸基团（-P）；

13、）；（2）需要有一种能源分子存在以提供羟基与磷酸基团之间形成磷酸二）需要有一种能源分子存在以提供羟基与磷酸基团之间形成磷酸二酯键时所需的能量。酯键时所需的能量。 大肠杆菌及其它细菌中：大肠杆菌及其它细菌中：NAD+（氧化氧化型烟酰胺腺嘌呤二（氧化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）核苷酸） 动物细胞及噬菌体中：动物细胞及噬菌体中： ATPOH35P（四）注意l被连接的两条被连接的两条DNA链必须是双螺旋链必须是双螺旋DNA分子的一部分，分子的一部分，DNA连接酶并不能连接两条单连接酶并不能连接两条单DNA分子或环化的单链分子或环化的单链DNA分子。分子。lDNA连接酶只能连接并封闭双螺旋连接酶只能连接

14、并封闭双螺旋DNA分子所出现的切口分子所出现的切口（Nick），即封闭双链），即封闭双链DNA上两个相邻核苷酸之间失去一个上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的断裂磷酸二酯键所出现的断裂GGTAC-OH P-CC-P HO-CATGG5 33 5GG-OH P-CCCCATGG5 33 5GGTACCCCATGG5 33 5三、激酶及碱性磷酸酯酶l碱性磷酸酯酶：除去DNA 5磷酸的酶l激酶：在DNA或RNA的5羟基(OH)端进行磷酸化的酶（作用结果是添加磷酸，可用于核酸的末端标记）四、DNA聚合酶和RNA聚合酶lDNA聚合酶（来自大肠杆菌） 功能：53 的聚合酶活性。53外切核酸酶活性

15、， 3 5外切核酸酶 利用：53 的聚合酶活性以及53外切核酸酶活性，切口平移大片段（ Klenow片段）：53 的聚合酶活性，3 5外切核酸酶小片段lDNA聚合酶lTaq DNA聚合酶（来自耐热细菌）l具有53 的聚合酶活性和3 5外切核酸酶，高度保真，产生平末端，不能进行TA克隆测序酶：具有53 的聚合酶活性，但不具备3 5外切核酸酶的T7DNA聚合酶。反转录酶：以RNA为模板合成DNA 的聚合酶第四节第四节 研究研究DNA和和RNA的方法的方法一、核酸的分离纯化l通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化

16、核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。l1、细菌培养物的生长和收集l确定成分的培养基(defined medium)，M9l不确定成分的培养基(undefined medium)， 如LB 蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段 酵母提取物：提供氮源，糖类以及其它有机与无机营养实例实例1：细菌：细菌DNA的提取的提取l2、细胞提取物的制备l细菌细胞的屏障:细胞膜和细胞壁l物理方法与化学方法化学方法l化学方法化学方法:l溶菌酶溶菌酶(消化细胞壁多聚物消化细胞壁多聚物)l EDTA(螯合钙离子螯合钙离子, 抑制抑制DNA酶的活性酶的活性)lSDS:去污剂去污剂,协助细胞壁的裂解协助细胞壁的裂解实例实例1：细菌：

17、细菌DNA的提取的提取3 从细胞提取物中纯化DNAl降解杂质,留下DNA(苯酚与氯仿的混合物,RNA酶)l离子交换层析,分离DNA(带正电荷的离子交换剂)4 DNA取样的浓缩l乙醇沉淀(破坏了DNA分子间的氢键)5 DNA浓度的测量 A260/A280=1.8实例实例1：细菌：细菌DNA的提取的提取l植物叶片用液氮碾磨成细末后转移到1.5ml离心管l加650l 在65度预热的CTBA提取液l水浴锅中65温浴40分钟后取出，静置冷却l加入650l苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀，静置5分钟l12000rpm 离心10 分钟实例实例2：植物：植物DNA的提取的提取l取上清液，加入2l（10

18、mg/ml）Rnase,37 度水浴30分钟l再抽提一次l取上清液，加入2倍体积的冷乙醇或等体积的异丙醇l轻轻摇动，待发现有白色絮状沉淀，用牙签挑出或6000rpm离心5分钟l70%的乙醇洗后，凉干。 实例实例2：植物：植物DNA的提取的提取实例实例3 质粒质粒DNA的制备的制备1 基于分子大小的分离2 基于构象的分离质粒有三种构型质粒有三种构型 lcccDNA(共价闭环共价闭环DNA)：DNA的两条链都是完整的两条链都是完整的。的。locDNA(开环开环DNA)：只有一条链是完整的。：只有一条链是完整的。l 线性线性DNA：DNA的两条链均被打开。多种细菌中存的两条链均被打开。多种细菌中存在

19、线性的质粒在线性的质粒DNA。但末端或是通过重复序列形成发。但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解降解。超螺旋超螺旋 DNA松弛cccDNA开环DNA核酸内切酶核酸内切酶DNA连接酶连接酶核酸内切酶核酸内切酶DNA促旋酶促旋酶拓扑异构酶拓扑异构酶l碱变性l用CsCl-EB等密度离心Upper band containing chromosomal DNA and open plasmid circlesLower band of covalently closed circles plasmid DNAEth

20、idium bromide (EB)包含质粒的细胞包含质粒的细胞用溶菌酶弱化细胞壁，用用溶菌酶弱化细胞壁，用NaOH和和SDS溶液裂解溶液裂解变性的染色体变性的染色体 DNA 用用acidic sodium acetate 中和中和染色体染色体DNA复性复性 形成不溶的网状物形成不溶的网状物高浓度的高浓度的acidic sodium acetate使使 protein-SDS 复合物复合物和高分子量的和高分子量的RNA 沉淀沉淀ccc DNA不发生变性，以天然状态溶解在溶液中不发生变性，以天然状态溶解在溶液中通过离心去除沉淀通过离心去除沉淀通过乙醇或异丙醇浓缩沉淀，或用凝胶过滤方法纯化质粒通过

21、乙醇或异丙醇浓缩沉淀，或用凝胶过滤方法纯化质粒DNA。二、凝胶电泳二、凝胶电泳l根据根据DNA或或RNA 分子的分子的大小大小，形状形状和拓扑和拓扑结构结构，将，将DNA和和RNA进行分离的技术。进行分离的技术。lDNA和和RNA在胶上的迁移性在胶上的迁移性 DNA或或RNA分子带有负电荷，在胶支持物上向正电极运动分子带有负电荷，在胶支持物上向正电极运动 线性线性DNA分子根据分子根据大小大小进行分离，小分子比大分子要泳动快，所以能将进行分离，小分子比大分子要泳动快，所以能将DNA分子进行分离分子进行分离 环状环状DNA分子的移动受拓扑分子的移动受拓扑结构结构的影响。相同分子量的情况下，超螺旋

22、的影响。相同分子量的情况下，超螺旋线性线性缺刻或松散缺刻或松散二、凝胶电泳二、凝胶电泳l琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶l是一种多聚糖，主要由琼脂糖（是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占，约占80%）及琼脂胶（）及琼脂胶（agaropectin）组成。）组成。l琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定鉴定l凝胶孔径的大小凝胶孔径的大小 随着浓度的增加而变小，有效分随着浓度的增加而变小，有效分离离DNA大小范围为大小范围为0.210KbDNA相对分子质量标准物相对分子质量标准物水平型平板电泳槽水平型平板电泳槽 二、凝胶电泳二、凝胶电泳l聚丙烯胺凝胶聚

23、丙烯胺凝胶l（acrylamide，简称，简称Acr）和交联剂）和交联剂N，N-甲叉甲叉双丙烯酰胺（双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称，简称Bis）在催化剂作用下合成的。）在催化剂作用下合成的。l凝胶孔径的大小决定于两者的总浓度以及比值凝胶孔径的大小决定于两者的总浓度以及比值l 分辨率比较高，能区分分辨率比较高，能区分12bp 差别的差别的DNA/RNA分子，分子，但只能分离几百但只能分离几百bp的的DNA/RNA分子分子三、三、 DNA测序l链终止法测序l化学降解法测序（自习）l自动化测序l非常规DNA测序（焦磷酸测序，芯片测序等）1、链终止法测序技术路线与要求

24、制备单链模板制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火将单链模板与一小段引物退火 加入加入DNA多聚酶多聚酶 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸分别加入少量分别加入少量4种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸 将将4种反应产物分别在种反应产物分别在4条泳道电泳条泳道电泳 根据根据4个碱基在个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列条泳道的终止位置读出基因序列 A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性B M13克隆单链DNAC 噬粒克隆DNAD PCR产生单链DNAA 高酶活性B 无53外切酶活性C 无35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基三、DNA测序2、自动测序基

25、本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火 加入DNA多聚酶（4种脱氧核苷酸） 分别加入少量4种荧光标记的双脱氧核苷酸 将产物在一个泳道上电泳，根据不同片段的荧光信号判读序列模板制备PCR 反应（测序反应）电泳核酸序列阅读2、自动测序2、自动测序第五节 膜印迹和核酸杂交Southern 印迹第五节 膜印迹和核酸杂交 Southern 印迹大致过程如下：(1) 提取组织中的DNA，并用内切酶消化，进行琼脂糖凝胶电泳。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置，以及信号的强度。 放射自显影核酸杂交过程 (photo film) Professor Sir Ed Southern, Whitley Professor of Biochemistry at the University of Oxford. “Real” Southern blot