实验二 外植体的灭菌与接种

1、1实验二 外植体的灭菌与接种2 一、实验目的 通过实验，初步掌握外植体植物材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织诱导和分化的方法。 v二、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组织，甚至单个细胞的过程。织，甚至单个细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培养成功的最基本的前提和重要保行组织培养，这是取得

2、组织培养成功的最基本的前提和重要保证。证。植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，通过脱分化，植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团愈伤组愈伤组织。织。植物生长调节剂是诱导外植体形成愈伤组织和愈伤组织分化的植物生长调节剂是诱导外植体形成愈伤组织和愈伤组织分化的重要影响因素。重要影响因素。 3v消毒目的：通过表面消毒剂杀死植物材料(外植体)表面微生物,同时要尽可能保持植物材料的生命力。v三、实验材料、试剂及器具三、实验材料、试剂及器具(1)材料：材料：烟草叶片(2)试剂及培养基试剂及培养

3、基10% aClO (全班配全班配2000mL)75%乙醇 (全班配全班配2000mL,已配已配)无菌水0.1%新洁尔灭 (全班配全班配2000mL，已配，已配)烟草叶片的培养基烟草叶片的培养基(8组组)(3)器具器具：超净工作台、无菌吸水纸、脱脂棉花、标签纸、记号笔、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀等4v四、操作步骤四、操作步骤v培养基、用具灭菌培养基、用具灭菌(实验一已完成实验一已完成)打开超净工作台紫外灯打开超净工作台紫外灯20min,关灯后要等关灯后要等20min才能进入实验室才能进入实验室进入接种室进入接种室:穿已灭菌工作服穿已灭菌工作服, 换拖鞋换拖鞋,接种接种前前75%酒精或酒精

4、或0.1%新洁尔灭擦手新洁尔灭擦手选取外植体选取外植体自来水冲洗自来水冲洗75%酒精浸泡酒精浸泡30saClO 浸泡15-20min无菌水冲洗无菌水冲洗4-5次次无菌吸水纸吸干无菌吸水纸吸干分割成边长为分割成边长为0.81cm的正方形的正方形火焰上方接种火焰上方接种盖紧瓶盖盖紧瓶盖培养培养在超净工作台上进行在超净工作台上进行贴标签贴标签清理超净工作台清理超净工作台5接种注意事项接种前接种前75%酒精或酒精或0.1%新洁尔灭擦手新洁尔灭擦手进入接种室进入接种室:穿已灭菌工作服穿已灭菌工作服, 换拖鞋换拖鞋接种时尽量不要说话接种时尽量不要说话(防交叉污染防交叉污染)不要在接种室来回走动不要在接种室

5、来回走动(防超净工作台气流波动防超净工作台气流波动) 6超净工作台的使用超净工作台的使用接种前，用接种前，用75酒精棉球或用酒精棉球或用1%新洁尔灭溶新洁尔灭溶液擦拭超净工作台台面液擦拭超净工作台台面将培养基及接种用具放入超净工作台台面将培养基及接种用具放入超净工作台台面打开超净工作台紫外灯，照射约打开超净工作台紫外灯，照射约2030 min关闭紫外灯，打开送风开关关闭紫外灯，打开送风开关通风通风10 min后后,开日光灯即可进行外植体的消开日光灯即可进行外植体的消毒和接种等无菌操作毒和接种等无菌操作7标签格式标签格式(例例)材料名称材料名称:烟草烟草(叶叶)培养基名称培养基名称:MS+NAA2mg/L+6-BA1mg/L接种日期接种日期: xxx姓名姓名:xxx8五、观察记录五、观察记录观察污染情况观察污染情况细菌性污染细菌性污染:菌斑呈粘液状菌斑呈粘液状,接种后接种后1-2天出现天出现真菌性污染真菌性污染:出现不同颜色出现不同颜色(霉菌霉菌),接种后接种后3-10天出现天出现材料发黄材料发黄,组织变软组织变软,可能是因消毒时间过长可能是因消毒时间过长,组织破坏死亡组织破坏死亡污染率污染率(%)=污染的材料数污染的材料数/接种材料总数接种材料总数100观察愈伤组织情况观察愈伤组织情况愈伤组织出现时间愈伤组织出现时间愈伤组织形态特征愈伤组织形态特征v颜色颜色v