《生物色谱技术》ppt课件

1、. 由于有同窗没有学习过色谱，我们大约引见一下色谱技术的来源。色谱技术最初就是俄国的植物学家茨维特发明的。1906年，茨维特在研讨植物色素的过程中，做了一个经典的实验：在一根玻璃管的狭小一端塞上一小团棉花，在管中填充沉淀碳酸钙，这就构成了一个吸附柱。然后将其与吸滤瓶衔接，使绿色植物叶子的石油醚抽取液自柱中经过。结果植物叶子中的几种色素便在玻璃柱上展开：留在最上面的是两种叶绿素；绿色层下面接着叶黄素；随着溶剂跑到吸附层最下层的是黄色的胡萝卜素。这样吸附柱成了一个有规那么的与光谱类似的色层。然后把该潮湿的吸附柱从玻璃管中推出，依色层的位置用小刀切开，于是各种色素就得以分别。再用醇为溶剂将色素溶解出

2、来，即得到了各成分的纯溶液，由此实现了色素的分别和制备。1903年，他将这一研讨成果发表在华沙的上，这就是有关色谱法的第一篇研讨论文。但当时他用俄文写的报告未能引起人们的兴趣，不断到他死后威尔施塔特重新引见了这种方法时，他的任务才遭到了人们的留意。.3 1903 Mikhail Tswett defines the Science of Chromatography Chromatography Inventor M. S. Tswett(茨维特). 生物色谱法生物色谱法Biochromatography是是20世纪世纪80年代年代中后期问世，由生命科学与色谱分别技术交叉构成的一中后期问世，由

3、生命科学与色谱分别技术交叉构成的一种极具开展潜力的新兴色谱技术。种极具开展潜力的新兴色谱技术。细胞膜色谱法细胞膜色谱法亲和色谱法亲和色谱法常规色谱法常规色谱法固定相含有生物大分子固定相含有生物大分子固定相和研讨对象都是生物大分子固定相和研讨对象都是生物大分子研讨对象是生物大分子研讨对象是生物大分子4. Cell Membrane Chromatography, CMC 将细胞膜结合到硅胶外表，制成细胞膜固定相，利将细胞膜结合到硅胶外表，制成细胞膜固定相，利用色谱学技术研讨流动相中药物与受体相互作用规律的用色谱学技术研讨流动相中药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法。受体动力学新方法。特点：分

4、别特点：分别 + 活性挑选活性挑选 合二为一合二为一 适宜于天然药物活性成分的挑选及药物作用机理的研讨。适宜于天然药物活性成分的挑选及药物作用机理的研讨。5.1A肾上腺素受体高表达细胞膜色谱肾上腺素受体高表达细胞膜色谱 a：酚妥拉明：酚妥拉明b：5-羟色胺羟色胺c：甲氧明：甲氧明d：羟甲唑啉：羟甲唑啉6abcd.Affinity Chromatography，AC 利用生物大分子具有对某一类生物大分子特异性识别利用生物大分子具有对某一类生物大分子特异性识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分别方法，也叫做和可逆结合的特性而建立起来的一种分别方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。生物亲和或生物

5、特异性亲和色谱。亲和识别亲和识别 ： 抗体抗体-抗原抗原 酶酶-底物底物 激素激素-受体受体载体载体配体配体7.IgG蛋白蛋白8.2. 配体与目的物吸附；配体与目的物吸附；3. 洗脱目的物；洗脱目的物；1. 找与底物专注可逆结合的配体找与底物专注可逆结合的配体, 将配体经过共价键偶联到载体。将配体经过共价键偶联到载体。94. 亲和柱再平衡。亲和柱再平衡。.特异性特异性亲和体系亲和体系高特异性高特异性抗原抗体抗原抗体荷尔蒙受体蛋白荷尔蒙受体蛋白核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白酶底物、产物、抑制剂酶底物、产物、抑制剂群特异性群特异性免疫球蛋白免疫球蛋白A蛋白、蛋白、G蛋

6、白蛋白酶辅酶酶辅酶凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞外表受体凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞外表受体酶、蛋白质肝素酶、蛋白质肝素酶、蛋白质活性色素染料酶、蛋白质活性色素染料酶、蛋白质过渡金属离子铜、锌等酶、蛋白质过渡金属离子铜、锌等酶、蛋白质氨基酸组氨酸等酶、蛋白质氨基酸组氨酸等10.核酸结合蛋白核酸结合蛋白11.A蛋白蛋白12 从从A型金黄色葡萄球菌型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分别而得的分别而得的一种细胞壁蛋白。可与人类大多数类型的一种细胞壁蛋白。可与人类大多数类型的IgG(IgG3除外除外)的的Fc段段结合，但很少或几乎不与人类的结合，但很少或几乎不与人类的IgM结

7、合。用于免疫分析和结合。用于免疫分析和IgG的的提纯。提纯。葡萄球菌葡萄球菌A蛋白蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)免疫球蛋白免疫球蛋白 Aimmunoglobulin A， IgA 已有研讨证明，呼吸道分泌液中已有研讨证明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影响呼吸含量的高低直接影响呼吸道粘膜对病原体的抵抗力，两者呈正相关。道粘膜对病原体的抵抗力，两者呈正相关。1. 与病毒或细菌毒素结合，从而阻止它们进入或破坏细胞；与病毒或细菌毒素结合，从而阻止它们进入或破坏细胞；2. 附着在细菌的鞭毛上，让其活动性减弱，并且更容易被巨噬细附着在细菌的鞭毛上，让其活动性减弱

8、，并且更容易被巨噬细 胞吞噬胞吞噬.13.14.无机氧化物：无机氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、葡聚糖等。生物聚合物：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、葡聚糖等。 配体配体载体载体间隔臂间隔臂固定相固定相1. 载体载体 support，又称基体，又称基体matrix 亲水但不溶于水，可溶胀；亲水但不溶于水，可溶胀； 大孔且有一定的机械强度；大孔且有一定的机械强度； 化学性质稳定且易于改性；化学性质稳定且易于改性； 外表积很大但呈现惰性；外表积很大但呈现惰性；15.专注性和特异性决议着分别纯化的产品纯度专注性和特异性决议着分别纯化的产品纯度相互作用

9、的强弱决议着吸附和解吸的难易程度相互作用的强弱决议着吸附和解吸的难易程度特异性配体特异性配体生物素亲和素、抗原抗体、酶抑制剂、激素受体生物素亲和素、抗原抗体、酶抑制剂、激素受体通用性配体通用性配体凝集素各种糖蛋白，核酸凝集素各种糖蛋白，核酸RNARNA、RNARNA蛋白质蛋白质2. 配位体配位体 ligand，又称底物，又称底物 substrate16. 脂肪族有机物或多肽、蛋白组成；脂肪族有机物或多肽、蛋白组成； 具有双官能团，一端衔接载体，一端偶联配体；具有双官能团，一端衔接载体，一端偶联配体； 长度直接影响固定相的立体效应；长度直接影响固定相的立体效应； 可在对载体进展化学改性的时候构成

10、；可在对载体进展化学改性的时候构成； 可具有疏水性或亲水性。可具有疏水性或亲水性。3. 间隔臂间隔臂 spacer或或spacer arms小分子物质作为配基，载体和配基间小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个插入一个“手臂以消除空间妨碍。手臂以消除空间妨碍。17.18阶梯式梯度阶梯式梯度线性梯度线性梯度.1. 离子强度：提高离子强度，亲和作用减弱或完全破坏。离子强度：提高离子强度，亲和作用减弱或完全破坏。2. pH值：在适当的值：在适当的pH下，亲和结协作用较高，在其它下，亲和结协作用较高，在其它pH下，下，亲和作用减弱或完全破坏。亲和作用减弱或完全破坏。3. 离液剂：脲和盐酸胍的存在可减

11、弱亲和作用。离液剂：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用。4. 温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；疏水性相互作用加强。疏水性相互作用加强。5. 液体离子：液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱。的存在，疏水性相互作用减弱。6. 螯合剂：影响配位键，使亲和作用消逝螯合剂：影响配位键，使亲和作用消逝19.北京东西分析仪器北京东西分析仪器LC-5600系列常中压生化制备液相色谱仪系列常中压生化制备液相色谱仪20GE公司.21.亲和柱亲和柱22.水水 + 乙腈乙腈23.24.重现性好！重现性好！25.26.分子量大的先被洗脱出来，

12、分子量大的先被洗脱出来，分子量小的后被洗脱出来。分子量小的后被洗脱出来。原理：是按分子大小顺序进展分别的一种色谱方法，原理：是按分子大小顺序进展分别的一种色谱方法， 体体积大的分子不能浸透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋积大的分子不能浸透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分浸透；小分子可完全浸透入洗出来；中等体积的分子部分浸透；小分子可完全浸透入内，最后洗出色谱柱。内，最后洗出色谱柱。27.28.原理：利用被分别组分与固定相之间发生离子交换才干的差原理：利用被分别组分与固定相之间发生离子交换才干的差 异来实现分别。异来实现分别。 29阳离子交换树脂阳离子交换树脂 大都含有磺酸基大都含有磺酸基(-SO3H)、羧基、羧基(-COOH)或苯酚基或苯酚基(-C6H4OH)等酸性基团，其中的氢离子能与溶液中的金属等酸性基团，其中的氢离子能与溶液中的金属离子或其他阳离子进展交换。离子或其他阳离子进展交换。2R-SO3H+Ca2+-(R-SO3)2Ca+2H+硬水软化原理硬水软化原理.30阴离子交换树脂阴离子交换树脂 大都含有季胺基大都含有季胺基-N(CH3)3OH、胺基、胺基(-NH2)或亚胺基或亚胺基(-NH2)等碱性基团。它们在水中能生成等碱性基团。它们在水中能生成