土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用课件

1、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用第一页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥农业氮肥(dnfi)(dnfi)。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后之后才能被植物利用。才能被植物利用。土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶+第二页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 芽孢杆菌芽孢杆菌(gnjn)(gnjn)、小球菌、假单胞杆菌、小球菌、假单胞杆菌(gnjn)(gnjn)、克氏、克氏杆菌杆菌(gnjn)

2、(gnjn)、棒状杆菌、棒状杆菌(gnjn)(gnjn)、梭状芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌(gnjn)(gnjn)，某，某些真菌和放线菌也能分解尿素。些真菌和放线菌也能分解尿素。从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌第三页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应求，到相应(xingyng)(xingyng)的环境中去寻找。的环境中去寻找。 问：问：如果如果(rgu)(rgu)请你寻找这种耐

3、高温的酶，你会去哪请你寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？里寻找？ DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCRPCR）是一种在体外将是一种在体外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项技术要求使用的技术，此项技术要求使用耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶（93930 0C C）。第四页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用问：问：为什么为什么TaqTaq细菌细菌(xjn)(xjn)能从热泉中被筛选出来？能从热泉中被筛选出来？ 水生耐热细菌水生耐热细菌TaqTaq：美国科学家布鲁克于美国科学家布鲁克于19661966年在年在美国黄石国家美国黄石国家(guji

4、)(guji)公园的一个热泉中发现，并分离出公园的一个热泉中发现，并分离出耐高温的耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶。聚合酶。第五页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，高温高温(gown)(gown)淘汰淘汰了绝大多数微生物（了绝大多数微生物（不耐热不耐热），只有），只有TaqTaq细菌被筛细菌被筛选出来。选出来。（一）筛选（一）筛选(shixun)(shixun)菌株菌株原理：原理：人为提供有人为提供有利于目的菌株利于目的菌株生长的条件生长的条件（包括营养、温度、（包括营养、温度、PHPH等），同时等）

5、，同时抑抑制或阻止制或阻止其他微生物生长。其他微生物生长。有选择作用第六页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：方法： 抑制抑制(yzh)(yzh)大多数微生物生长大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境，结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。布平板法等方法对它进行纯化培养分离。第七

6、页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用从物理性质从物理性质(wl xngzh)(wl xngzh)看此培养基属于哪类？从功能看此培养基属于哪类？从功能上上属于哪类培养基？属于哪类培养基？固体固体(gt)(gt)培养基培养基葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 尿素尿素选择培养基选择培养基第八页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能只有能合成脲酶合成脲酶的微生物才的微生物才能利用尿素作为氮源而生存能利用尿素作为氮源而生存。 缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而

7、受到抑制，所以而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以(suy)(suy)用此用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。培养基就能够选择出分解尿素的微生物。第九页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用组别组别培养基类型培养基类型是否涂是否涂布接种布接种目目 的的实验组实验组以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源的选择性培养基的选择性培养基是是对照组对照组牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基培养基是是分离尿素分离尿素(nio s)细菌细菌用以判断用以判断(pndun)选择性选择性培养基是否具有选择性培养基是否具有选择性对设计实验对设计实验(shyn)的训练的训练第十页，共三十八页。土壤中分解尿素的

8、细菌的分离和计数-上课用 对照组对照组牛肉牛肉(ni ru)(ni ru)膏蛋白胨培养基膏蛋白胨培养基 实验组实验组以尿素以尿素(nio s)(nio s)为氮源的培养为氮源的培养基基第十一页，共三十八页。常用方法：常用方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法、显微镜直接、显微镜直接计数法，计数法， 还可以还可以(ky)(ky)用过滤膜法用过滤膜法：当样品的稀释度足够高时，培养：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。就能推测出

9、样品中大约含有多少活菌。 1 1个菌落个菌落 = 1 = 1个活菌个活菌 第十二页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 （2 2）操作方法：稀释涂布平板）操作方法：稀释涂布平板 统计统计(tngj)(tngj)菌落数。菌落数。（3 3）统计原则）统计原则 、选、选 30 30300 300 个菌落的平板统计。个菌落的平板统计。 、每个稀释度取、每个稀释度取3 3个平板取其平均值个平板取其平均值。（4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低低，因，因此此(ync)(ync)统计结果一般用统计结果一般用菌落数菌落数来来表示。表示

10、。第十三页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用同学同学平板平板1 1平板平板2 2平板平板3 3平均数平均数评价评价甲甲230230230230乙乙2121212212256256163163结论结论启示启示没有设置重复组，因此结果没有设置重复组，因此结果(ji gu)不具说服力。不具说服力。1 1个平板的计数结果与另个平板的计数结果与另2 2个个相差相差(xin ch)(xin ch)太远，说明在操太远，说明在操作过程作过程中可能出现了错误。中可能出现了错误。不能简单地将不能简单地将3 3个平板的计数值个平板的计数值(shz)(shz)用来求平均值。用来求平均值。在设计实验

11、时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。统计菌落数目统计菌落数目 P22第十四页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用第十五页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 在做本课题的实验时，在做本课题的实验时，A A 同学从对应同学从对应10106 6倍稀释的

12、培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约5050个菌落。个菌落。 其他同学认为其他同学认为A A同学的结果有问题。他们分析可能是同学的结果有问题。他们分析可能是A A同学的培养基被杂菌同学的培养基被杂菌污染污染(wrn)(wrn)了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。的细菌也能在该培养基上生长。 但是，但是，A A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，同学

13、确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A A同学在设计实验的时候并没有设置对照，同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。因而此时也拿了不出令人信服的证据。 你能通过设置对照，帮助你能通过设置对照，帮助A A同学学排除上述两个可能影响实验结果的同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？因素吗？ 第十六页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响对实验结果的影响(yngxing)(yngxing)

14、，提高实验结果的可信度。，提高实验结果的可信度。设置对照设置对照(duzho)的方法：的方法： 空白对照：不给对照组任何处理因素。空白对照：不给对照组任何处理因素。 条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理处理因素。因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同一

15、是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。第十七页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用小结：通过小结：通过(tnggu)这个事例可以看出，实验结果要有这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案方案(fng n)一：一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情况下同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为进行培养，作为(zuwi)空白对照，以证明培养基是否空白对照，以证明培养基是否受到污染。受到污染。结果

16、预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；如果无误；如果结果不同，则证明结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有同学存在操作失误或培养基的配制有问题。问题。第十八页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。灭菌。制备以尿素制备以尿素(nio s)(nio s)为唯一氮源

17、的为唯一氮源的选择培养基选择培养基。第十九页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程在稀释土壤溶液的过程(guchng)(guchng)中，每一步都要在火焰旁进行中，每一步都要在火焰旁进行分离分离(fnl)(fnl)不同的微生物采用不同的稀释度不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数的之间、适于计数的平板平板第二十页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用微生物的种

18、类微生物的种类土壤稀释倍数土壤稀释倍数目标目标分离土壤中所有细菌分离土壤中所有细菌10104 4、10105 5、10106 6平板上的菌落数应为平板上的菌落数应为3030300300个，便于准个，便于准确计数。确计数。分离土壤中的放线菌分离土壤中的放线菌10103 3、10104 4、10105 5分离土壤中的真菌分离土壤中的真菌10102 2、10103 3、10104 4分离土壤中的尿素细菌分离土壤中的尿素细菌10104 4、10105 5、10106 6、10107 7（二）土壤（二）土壤(trng)稀释稀释二、实验设计二、实验设计第二十一页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计

19、数-上课用10101 110102 210103 310104 410105 510106 610107 710g土壤土壤9ml无菌水无菌水 9ml 无菌水无菌水1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml10104 410104 410104 410105 510105 510105 510106 610106 610106 610107 710107 710107 7稀释涂布平板法稀释涂布平板法第二十二页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030030300的平板，则的平板，则说明稀释操作比较成功

20、，并能够进行菌落的计数，如果说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要需要(xyo)(xyo)重新实验。重新实验。第二十三页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用第二十四页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用第二十五页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样形态多样(

21、du yn)(du yn)，菌落数偏高，难以选择出分，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个菌落个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。较大，表示实验不精确。第二十六页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用（圆形，假根状，不规则状）（圆形，假根状，不规则状）（光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心圆状）（光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心

22、圆状）（扩展，台状，凹面，凸面，乳头状）（扩展，台状，凹面，凸面，乳头状）（整齐，波状，裂叶状，锯齿状）（整齐，波状，裂叶状，锯齿状）（无光泽，金属光泽，闪光）（无光泽，金属光泽，闪光）（油脂状，膜状，粘脆）（油脂状，膜状，粘脆）第二十七页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用第二十八页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高升高(shn o)(shn o)，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。指示剂将变红，说明该细菌能够

23、分解尿素。第二十九页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用第三十页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用第三十一页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用六、例题六、例题(lt)解析解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种至少接种(jizhng)(jizhng)一种细菌一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。

24、这些是人们在一定条件下进行的。这些(zhxi)条件是：一条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长

25、规律。在接种时，要保证一会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。定的接种量。答案：答案：A A第三十二页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著争最显著(xinzh)(xinzh)最激烈的时期是最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，

26、种内斗争的程度是和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目比较低的。随着微生物个体数目(shm)(shm)的增加，每个个体的生存空间越来越的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，期，微生物的数目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物的生存，次已经极度不适于微

27、生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。境的斗争。答案答案(d n)(d n)：C C第三十三页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培

28、养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别(qbi)(qbi)3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素A AC CD D第三十四页，共三十八页。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ）

29、 A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除设置对照实验的主要目的是排除(pich)(pich)实验组中非测试因素实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。同其他生物环境相比，土壤中的微生物数