TTC肉汤二倍稀释法测MIC

1、几种抗菌药物的最小抑菌浓度的几种抗菌药物的最小抑菌浓度的测定测定MIC试验试验 （微量肉汤二倍稀释法）（微量肉汤二倍稀释法）一、目的 1、掌握微量肉汤二倍稀释法测定抗菌药物MIC的基本步骤，能准确测出各种抗菌药物的MIC值，了解单药的抗菌活性 2、为后面的棋盘法设计棋盘做准备，求取棋盘的中心浓度 二、意义 1、通过对MIC值的测定了解药物的体外抗菌活性 2、为临床选药提供依据 3、耐药检测三、菌种 1、大肠杆菌（标准菌株25922） 2、沙门氏菌（标准菌株） 3、金色葡萄球菌（标准菌株）（以上三种菌株均由中国兽药监察所提供）四、药品 硫酸庆大霉素（批号： 含量： 厂家： ） 阿莫西林（批号：

2、含量： 厂家： ） 硫酸四环素（批号： 含量： 厂家： ） 恩诺沙星（批号： 含量： 厂家： ） 阿米卡星（批号： 含量： 厂家： ） 氟苯尼考（批号： 含量： 厂家： ）五、培养基 MH肉汤培养基、用去离子水配制5g/L显色剂TTC（氯化三苯四氮唑）六、器材 96孔细胞培养板、培养皿、移液枪、 1ml和200 l枪头、EP管、锥形瓶、试管架、酒精灯、酒精棉球等 分析天平、超净工作台、37度恒温培养箱、烘箱七、方法步骤 1、药液的配制及除菌 配制 根据药物的效价或是含量及所需要的体积，计算出药物所需的量，并准确称取所需的各种抗菌药物，用适宜的溶剂及稀释及稀释剂将药物稀释至所需的浓度。 除菌 抗

3、菌素药物通过过滤的方式过滤；化学合成类药物通过过滤或是高压灭菌的方式进行除菌。 2、不同的抗菌药物原液配制所需的溶剂 溶剂为PH4.5PBS缓冲液的：四环素类 溶剂为PH6.0PBS缓冲液的：青霉素G，半合成青霉素类，头孢菌素类，多粘菌素B硫酸盐 溶剂为PH7.8PBS缓冲液的：氨基糖苷类，林可或氯林可霉素 3、MIC的测定（微量二倍稀释法） 第一步：在96孔板每个孔加入含TTC的空白肉汤100l 。 图表 第二步：在A/B/C三排的第一孔加配好的药液A(浓度为512IU/ml或g/ml)100 l，然后对药物进行二倍稀释。即，第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少三次以上）使药物与肉汤充分

4、混匀，然后吸取100l加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，吸取100l弃去;此时每孔药物浓度从左到右依次为：256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125(单位:IU/ml或g/ml) 图表第三步：再在每一孔中加入稀释好的菌液100l,这样就形成测定一个药物MIC值的三次重复（A/B/C三排样品）。此时每孔药物浓度即最终药物浓度从左到右依次为： 128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06(单位:IU/ml或g/ml)； 图表 第四步：在同一块板上的G排上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和在H排

5、上做一排阳性对照（加菌液不加药液） 第五步：将96孔板放入37度恒温培养箱1620小时后，观察结果。 图表 123456789101112A肉汤100ul药A100ul菌液100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ulB同A排C同A排D肉汤100ul药B100ul菌液100ulE同D排F同D排G阴性对照H阳性对照药物浓度12864321684210.50.250.1250.0625 第一步 第二步 第三步 第四步八、观察及判断结果 1、若有菌生长TTC会显示红色；若没有细菌生长TTC则不变色。 2、MIC值的判定：96孔

6、板上横排中未变红色的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值。 3、观察所做的阴性对照和阳性对照结果 4、记录结果并将每种药物的MIC值报告老师九、注意事项：1、无菌操作 除移液枪和96孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理 超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒；不能拿酒精面球球擦挡板！ 操作前洗手，用酒精棉球擦手 每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过；移液枪和枪头不能在究竟灯上烤！ 操作过程中加液尽可能不将96孔板盖完全打开 2、其他注意事项： （1）培养板上用标签纸做好标记，写明组别，做什么菌、什么药，以及各组对照。 （2）每药做三个重复，每个板做一个阴性对照和一个阳性对照。 （3）废液缸，超

7、净台内用过的不需要的东西都必须放到废液缸内，不能在台面乱扔。 （4）实验完后要收拾好台面，所有公用设施恢复原位。 十、记录结果的格式 例如：菌对药的MIC值（g/ml或是UI/ml）受试菌株 药物（ UI/ml ） 四环素 氟苯尼考金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 沙门氏菌十一、讨论 1、微量肉汤二倍稀释法应注意那些环节才能准确测定MIC？ 2、MIC试验对临床选药的意义以及它的局限性？ 3、TTC的作用机理？十二、分组 整个班分为6个组，每组11人。 1、2组做8种药对大肠杆菌的最小抑菌浓度 3、4组做8种药对沙门氏菌的最小抑菌浓度 5、6组做8种药对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度 1、2、3组在今天上午完成实验，4、5、6组在下午过来完成实验。每个大组要做4块96孔板，由4个同学来完成！