原核表达系统ppt课件

1、原核表达系统原核表达系统*基因公司技术讲座基因公司技术讲座*原原 核核 表表 达达 系系 统统 分分 类类分分 类类 方方 式式分分 类类表达调控方式组成型，诱导型表达产物定位分泌型，不分泌型细胞内、细胞膜、周质空间）产物纯化方式是否融合蛋白、是否一步亲和纯化产物溶解状况可溶、包含体、分泌型 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司* 基因功能研究基因功能研究* 重组蛋白特性研究重组蛋白特性研究* 重组蛋白制备重组蛋白制备/制药制药主主 要要 用用 途途 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司NEB NEB 公公 司司

2、的的 IMPACTTM IMPACTTM 系系 统统Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag采用了最新的采用了最新的“可诱导的内含肽自身剪切可诱导的内含肽自身剪切 ”技术，技术，使内含肽在适当的使内含肽在适当的pH或还原条件进行自身剪切，无或还原条件进行自身剪切，无需另外加入蛋白酶就可将目的蛋白经过一步亲和层析需另外加入蛋白酶就可将目的蛋白经过一步亲和层析从融合表达的蛋白中分离出来，大大提高了纯化效率。从融合表达的蛋白中分离出来，大大提高了纯化效率。InteinCBDMCSTarget GeneChitin

3、 Binding DomainChitin-bound intein tagMultiple cloning site世界首创世界首创独家提供独家提供内内 含含 肽肽 （Intein)Intein)内含肽是一种蛋白剪切元件内含肽是一种蛋白剪切元件Protein splicing element), 是一些读框区中打断宿主基因是一些读框区中打断宿主基因 编码区的序列。与内含子编码区的序列。与内含子(Intron) 不同的是，它们是在翻译后通过自身催化的蛋白剪切不同的是，它们是在翻译后通过自身催化的蛋白剪切机制从蛋白前体中被剪切的。机制从蛋白前体中被剪切的。InBase(The Intein Da

4、tabase)NEBs web site:Technical Resource sectionIMPACT-CN IMPACT-CN 系系 统统特特 点点* 操作灵活目的蛋白可在C端或N端与标记融合* 目的蛋白产物序列不变* 一步亲和纯化无需另加蛋白酶除亲和标记* 严谨的转录控制* 目的蛋白能够进行C端标记独家的Intein 介导的肽连接技术IPL）IMPACT-CN IMPACT-CN 系系 统统 流流 程程IMPACT-TWIN IMPACT-TWIN 系系 统统特特 点点* 操作灵活目的蛋白可在C端或N端与标记融合* 目的蛋白产物序列不变* 一步亲和纯化无需另加蛋白酶去除亲和标记* 可选

5、择硫醇试剂或pH和温度条件诱导Intein 自身剪切* IPTG诱导的T7启动子，可实现高水平表达及严谨的表达调控* 唯一可直接产生带N端Cys 和C端硫酯 的蛋白的表达纯化系统 纯化产物可方便地进行标记、连接及环化等操作独家的Intein 介导的肽连接技术IPL） Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司IMPACT-TWIN IMPACT-TWIN 系系 统统 流流 程程 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司Protein cyclization Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公

6、公 司司 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司NEB NEB 公公 司司 的的 IMPACTTM IMPACTTM 系系 统载统载 体体 选选 择择VectorsIntein length(amino acids)Target proteinFusion sitePreferred residuesat cleavage siteCleavage methodApplicationsIMPACT-CN KitpTYB1,2454C-terminusAll except: P C N D RThiolPurification;C-terminal thio

7、ester forprotein ligationpTYB11,12510N-terminusAll except: P S C TThiolPurificationIMPACT-TWIN KitpTWIN1154198N-terminusC-terminusS C G A M TAll except: S P E D G ApH & temperatureThiolPurification;C-terminal thioester;defind N-terminus(e.g.Cys); proteinligation and cyclizationpTWIN2154134N-term

8、inusC-terminusS C G A M TG ApH & temperatureThiolPurification;C-terminal thioester;defind N-terminus(e.g.Cys); proteinligation and cyclizationSold SeparatelypTYB3,4 and pKYB1454C-terminusAll except: P C N D RThiolPurification;C-terminal thioester forprotein ligationpTXB1,3198C-terminusAll except

9、: P C N D RThiolPurification;C-terminal thioester forprotein ligationpMALpMAL蛋白融合及纯化系统蛋白融合及纯化系统特特 点点* 表达量高，稳定可靠 经验证，75%以上的样本产量高达100mg/L* 产物可分布细胞质或周质空间 分布周质空间可增强有二硫键的蛋白的折叠* 与MBP融合可增加表达蛋白的溶解性* 温和洗脱条件 不用去垢剂及强烈变性 A1:未诱导细胞未诱导细胞 A2:诱导细胞诱导细胞 B1: 直链淀粉柱第一次纯化直链淀粉柱第一次纯化 B2: Factor Xa 处理后处理后 B3: 直链淀粉柱第二次纯化直链淀粉柱

10、第二次纯化 pMAL-C2: 无信号顺序，融无信号顺序，融合蛋白产物定位于细胞质中合蛋白产物定位于细胞质中 pMAL-P2: 含信号顺序，融含信号顺序，融合蛋白分泌表达于细胞周质合蛋白分泌表达于细胞周质载载 体体 选选 择择产产量量产产物物占占总总蛋蛋白白比比例例产产物物稳稳定定性性蛋蛋白白折折叠叠pMAL-C220-40%更稳定pMAL-P2100mg每升培养物5-10%特殊折叠必需:帶二硫键PRO Bacterial Expression SystemPRO Bacterial Expression System Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司

11、- CLONTECH-特特 点点* 严谨调控，高水平诱导表达严谨调控，高水平诱导表达 新型的杂合启动子和操纵子，低背景，高新型的杂合启动子和操纵子，低背景，高表达，调控精确，可用于有毒或抑制生长的表达，调控精确，可用于有毒或抑制生长的蛋白表达。蛋白表达。* 产物便于纯化产物便于纯化 N-端带有端带有c-Myc 亲和标记和肠激酶位点亲和标记和肠激酶位点* 改造方便改造方便 载体的三个主要的功能区各配有单一酶切位载体的三个主要的功能区各配有单一酶切位点，用户可根据需要对载体进行改造。点，用户可根据需要对载体进行改造。PRO Bacterial Expression SystemPRO Bacter

12、ial Expression System- CLONTECH- Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司PRO Bacterial Expression SystemPRO Bacterial Expression SystemSimultaneous, independent expression of two proteins The pPROTet.E332-lacZ and pPROLar.A222-Luc Control Vectors were simultaneously propagated in DH5PRO- CLONTECH- Gen

13、e Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司HAT Protein Expression & HAT Protein Expression & Purification SystemPurification System- CLONTECH- Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司特特 点点* 可在中性可在中性pH条件下纯化蛋白条件下纯化蛋白 有效去除杂质有效去除杂质* 纯化可采用变性或非变性条件纯化可采用变性或非变性条件 降低蛋白酶活性，提高蛋白稳定性降低蛋白酶活性，提高蛋白稳定性* 提供纯化的专用树脂：提供纯化

14、的专用树脂：TALONIMAC 钴离子高度专一地亲和钴离子高度专一地亲和HAT和其它和其它6His蛋蛋白，且洗脱条件温和，保证蛋白完整性白，且洗脱条件温和，保证蛋白完整性* pHAT-GFPuv 载体还带有荧光标记载体还带有荧光标记 极大的方便了表达产物的检测、定位及纯化极大的方便了表达产物的检测、定位及纯化HAT Protein Expression & HAT Protein Expression & Purification SystemPurification System- CLONTECH- Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司

15、司QIAexpressQIAexpress以以6 6HisHis标记和标记和 Ni-NTANi-NTA亲和亲和纯化为基础的完整的表达纯化纯化为基础的完整的表达纯化系统系统特特 点点* 表达量高 表达产物可占总蛋白的50%* 严谨调控 IPTG诱导的T5启动子，可表达有毒蛋白* 基因克隆灵活： 可选择N-端或C-端融合标记 可选择一端或两端6His标记* 纯化方便：一步纯化 可选择变性或不变性条件 可选择多种灵敏的检测方法 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司QIAexpressQIAexpress以以6 6HisHis标记和标记和 Ni-NTANi-NT

16、A亲和亲和纯化为基础的完整的表达纯化纯化为基础的完整的表达纯化系统系统 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司QIAexpressQIAexpress以以6 6HisHis标记和标记和 Ni-NTANi-NTA亲和亲和纯化为基础的完整的表达纯化纯化为基础的完整的表达纯化系统系统 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司QIAexpressQIAexpress以以6 6HisHis标记和标记和 Ni-NTANi-NTA亲和亲和纯化为基础的完整的表达纯化纯化为基础的完整的表达纯化系统系统 Gene Company Limit

17、ed 基基 因因 有有 限限 公公 司司 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司纯化流程QIAexpressQIAexpress以以6 6HisHis标记和标记和 Ni-NTANi-NTA亲和亲和纯化为基础的完整的表达纯化纯化为基础的完整的表达纯化系统系统 Gene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司表表 达达 系系 统统调调 控控 方方 式式纯纯 化化 方方 式式特特 点点原原 理理CBD-intein融合于目的蛋白N 端或C 端,可将C B D-intein融 合 于目的蛋白N 端或利用i n tein在 还 原条件下裂

18、解的特性便于亲和纯化并分离目的蛋白纯品C端, 无 需蛋白酶切即可将融合端去除将目的蛋白的融合端去除可在目的蛋白的两端加上C B D -目的蛋白两端的i n t e i n 不同 ,一 是 在intein融合物, 分别用 p H 和t h i ol洗脱pH7的条件下裂解另一为还原条件pMAL Protein Fusion & Ptac 启动子诱导表达可溶每升培养物产量高达1 0 0 m g , 产物 分MBP促进融合蛋白溶解性, 特异结合Purification Kit产物布细胞质和周质空间, 有蛋白酶切位点Amylose可除去N 端融合 物PROTet Bacterial PLtet0-1启动子严谨调控 诱导产物可达2 5 0 0 倍, 表 达 量 高 达总蛋aTc与T et阻 遏物结合, 调控P L t et 0 - 1Expression Systemanhydrotetracucline调控白的1 0 %启动子PROLar Bacterial Plac/ara-1启动子更严谨杂和启动子提供更强的表达能力,Expression Vectors的调控更严格调控HAT Protein Expression EK位点可供E n t e rkinase切 除 N