生物化学试验基本操作玻璃仪器的规格和使用吸管

1、第二章生物化学实验根本操作第一节玻璃仪器的规格和使用一、吸管的使用计量仪器的选择应根据量取液体的体积大小而定，同时要考虑量取的准确度表2-20。表2 -1计量仪器的选择标准计量仪器最正确量程准确度滴管30 M 至 2ml低量筒5-2000ml中等容量瓶5-2000ml高滴定管1-25ml高吸管/移液枪5 d 至 10ml高微量注射器0.5-10ml高天平任何量度取决于天平的准确度极高锥形瓶/烧杯25-5000ml极低吸管吸量管为精密计量容器，生化实验中经常使用。一吸管的类型1 移液管即单刻度吸管1普通单标吸管它的中部有一圆柱状空泡，只能量全量。当所量取的液体自行流出后，使吸管尖端在受壁上停留3

2、-5秒，所余少量液体不必吹出，因为其固定倾出容量已经检定。2奥氏吸管它具有一相当大的卵形空球及一短小的出口。当将所量取的液体放出后， 必须将遗留在管尖内的少量液体吹入受器内。某些奥氏吸管带有玻璃塞。在所有的吸管中以奥氏吸管的准确度最高，常用于定量实验。2. 吸管 即多刻度吸管1普通吸管它是直筒状吸管，其上有多个刻度。北京玻璃厂生产的吸管，1ml以下不包括1ml都必须把尖端遗留的液体吹入受器中，新产品都注明有“吹字。1ml以上包括1ml那么不吹出 尖端遗留的液体。当液体不再流出时， 应使该管尖紧靠受器内壁一段时间。 这种吸管又分为 慢流速、快流速2种。按其容量和精密度不同，慢流速吸管又分为 A与

3、B级，快流速吸管只 有B级。使用时，A级最后停留15秒，B级最后停3秒，同时需转动吸管。2莫氏吸管总量刻度在尖端以上，卸放液体时按刻度进行。二刻度吸量管移液操作1. 选取原那么：每根吸量管上有许多等分的刻度，在刻度标记有自上而下和自下而上两种，规格为0.1 ml，0.2 ml，0.5ml，1ml，2 ml，5 ml，10 ml等。在一次完成移液的前提下， 应选用容积较小的吸量管，对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管。2 操作过程：图2 1刻度吸量管移液操作1执管：拇指执吸量管上部，使吸量管保持垂直，食指按在管口上调节流速，刻度 朝向操作者；2取液：把吸量管插入液体，用洗耳球吸取

4、液体至所需刻度上方，移开洗耳球，迅速用食指压紧管口， 然后抽离液面。调准刻度：用食指控制液体至所需刻度 此时液体凹面、 视线和刻度应在同一水平线上 3放液：移开食指，让液体自然流入容器内。此时，管尖应接触容器内壁，但不应插入容器的原有液体中否那么管尖会沾上容器内试剂，再移液时致使试剂交叉污染。待液体 流尽，将最后液滴吹出或转动吸量管使其沿容器内壁流出。4洗涤：吸取血浆，尿及粘稠试剂的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。如果 吸取一般试剂的吸量管，可待实验完毕后再洗。三吸管使用考前须知1. 对于多刻度吸管，有刻度到尖端的和不到尖端的；有读数是从上而下的，也有读数是从下而上的。使用时必须看清楚，以

5、免发生过失。2执管时，要尽量拿上部，以食指堵住管口控制流量，刻度数字要向着自己。3不管使用哪一种吸管，都应以食指堵住吸管的上孔。当从液体中取出后，特别是吸 取粘性大的液体时， 必须先用滤纸将管的外壁擦干。 放出所需液体时， 必须使吸管尖端轻轻 触及受器的内壁。4吸取溶液时要把吸管插入适当深度，防止吸空。严禁用口吸取，应在管口上方用一 橡皮球吸而获取溶液。5. 应根据不同的需要量选用适当的吸管。例如吸取1. 5ml溶液时，以选用2ml吸管为宜， 而5ml和10ml的均不适用。假设以1ml的吸取2次，那么因误差时机增多而不适宜。6. 读数时，管要垂直背对光线，眼与凹液面应在同一水平高度上。7. 吸

6、管的洗涤 : 吸管用后，要以自来水冲洗数次，晾干后，以重铬酸钾 -硫酸洗液浸泡 1 小时以上。 如果是放入大量筒中浸泡， 要注意在筒下应垫有玻璃纤维， 并将吸管的尖嘴朝上。 尖嘴局部假设碰破残缺，那么吸量不准；上口碰破残缺，那么流量不易控制；二者均不宜使用，因 此要细心保管。四吸管的校正首先以分析天平称出带盖称量瓶重量， 然后用洁净枯燥的吸管吸取蒸馏水至刻度处， 将 蒸馏水移入称量瓶内，盖好盖再称其重，由前后 2次的称量值求出吸管中水的重量，重复称 量2 -3 次取其平均值。再按水在校正温度下的相对密度求得校正体积。二、微量可调加液管微量可调加液管常用于吸取 1ml 以内的微量液体。 此管由塑

7、料制成， 具有使用方便、 取 液迅速、不易破损、 能吸取多种样品等优点。 适用于连续取样和试液分装， 目前广泛使用于 临床生化检验中。 微量可调加液管一般为 5 档调节， 其规格可根据需要选择， 生化实验常选 用50、100、150、200和250卩l的微量可调加液管。微量可调加液管在正式使用前， 要连续按动屡次， 使管内空气同工作环境空气进行交换， 保持管内空气工作负压恒定。 使用时将塑料吸液嘴套在加液管头上， 轻轻转动， 以保持密封。 垂直地握住加液管，将按钮按到第1停止点，并将吸液嘴浸入液面下23伽，缓慢地放松按钮，使之复位，12秒钟后从液体中取出。再将加液管移至准备好的容器内，缓慢地将

8、 按钮按到第 1 停止点，等待 1 2秒钟后再将按钮完全按下，排出液体。使用不同的试液应更换塑料吸液嘴。三、量筒量筒在准确度要求不高的情况下， 用来量取相对大量的液体。 不需加热促进溶解的定性 试剂可直接在量筒中配制。 量筒的规格有 10ml、25ml 、50ml、100ml 、250ml、500ml 、1000ml 等多种。四、容量瓶容量瓶是一种较准确的容量仪器， 带有磨口瓶塞， 上部是细小呈圆柱形的颈部并刻有环 形的刻度， 下部是膨大呈壶腹状的瓶身。 使用前应检查容量瓶的瓶塞是否漏水， 瓶塞应系在 瓶颈上， 不得任意更换。 用容量瓶配制溶液时， 固体物质必须先在小烧杯中溶解或加热溶解， 冷

9、却至室温后才能转移到容量瓶中， 然后加溶剂稀释至标线。 当溶剂加到快要接近标线时应 停顿 30 秒左右，待瓶颈上部液体流下后，再小心逐滴参加，直至溶液的弯月面最低点与标 线相切。容量瓶绝不能加热或烘干。容量瓶的规格有10ml 、 25ml、 50ml 、100ml 、 250ml 、50ml0、 1000ml 等多种。第二节 玻璃和塑料仪器的清洗与枯燥一、玻璃仪器的清洗实验中所用的玻璃仪器清洁与否， 直接影响实验的结果， 做生物化学实验对玻璃仪器清 洁程度的要求， 比一般化学实验的要求更高。 这是因为生物化学实验中蛋白质、酶、核酸等 往往都是以“毫克和“微克计的，稍有杂质，影响就很大。生物化学

10、实验对许多常见的 污染杂质十分敏感， 如金属离子 钙、铁离子等 、去污剂和有机物等， 因此玻璃仪器是否彻 底清洗净就显得非常重要。1. 初用玻璃仪器的清洗新购置的玻璃仪器外表常附着有游离的碱性物质，可先用 0.5%去污剂洗刷， 再用自来水洗净，然后浸泡在 1%-2%盐酸溶液中过夜 不可少于 4h ，再用自来水冲洗，最后用无离子水 冲洗2次，在100-120 C烘箱内烘干备用。2. 使用过的玻璃仪器的清洗 1 一般玻璃仪器试管、烧杯、锥形瓶等 包括量筒 等一般玻璃仪器，选用大小适宜的毛刷，先用自来水 洗刷至无污物；再沾取洗涤净稀释液或浸入洗涤净稀释液内，将器皿内外特别是内壁 细心刷洗，用自来水冲

11、洗干净后，蒸馏水冲洗23次，烤干或倒置在清洁处，干后备用。凡洗净 的玻璃器皿，不应在器壁上带有水珠，否那么表示尚未洗干净， 应再按上述方法重新洗涤。假设 发现内壁有难以去掉的污迹，应分别试用各种洗涤剂予以去除，再重新冲洗。) (2 量器 移液管、滴定管、量瓶等量器。使用后应立即浸泡于凉水中，勿使物质干涸。工作完毕 后用流水冲洗， 去除附着的试剂、 蛋白质等物质， 晾干后浸泡在络酸洗液中 小时 46或过夜， 再用自来水充分冲洗、最后用蒸馏水冲洗24次，风干备用。3. 石英和玻璃比色皿的清洗石英和玻璃比色皿绝不可用强碱清洗， 因为强碱会浸蚀抛光的比色皿。 只能用洗液或 1% -2%的去污剂浸泡，然

12、后用自来水冲洗，清洗干净的比色皿应是内外壁不挂水珠。洗刷仪器时，应首先将手用肥皂洗净，免得手上的油污附在仪器上，增加洗刷的困难。 如仪器长久存放附有尘灰，先用清水冲去，再按要求选用洁净剂洗刷或洗涤。如用去污粉， 可先将刷子蘸上少量去污粉，把仪器内外全刷1遍，再边用水冲边刷洗至肉眼看不见有去污粉时，用自来水洗 3 -6 次，再用蒸馏水冲 3次以上。一个洗干净的玻璃仪器，应该以挂不住 水珠为度。 如仍能挂住水珠，那么需要重新洗涤。用蒸馏水冲洗时， 要用顺壁冲洗方法并充分 振荡， 经蒸馏水冲洗后的仪器， 用指示剂检查应为中性。 做痕量金属分析的玻璃仪器， 使用 ( 1:1 )-(1:9) HN0 3

13、溶液浸泡，然后进行常法洗涤。进行荧光分析时，玻璃仪器应防止使用 洗衣粉洗涤 ( 因洗衣粉中含有荧光增白剂， 会给分析结果带来误差 ) 。分析致癌物质时， 应选 用适当洗液浸泡，然后再按常法洗涤。二、塑料器皿的清洗聚乙烯、 聚丙烯等制成的塑料器皿， 在生物化学实验中已被使用得越来越多。 第一次 使 用塑料器皿时，可先用 8mol/L 尿素 (用相对密度为 1.19 的浓盐酸调 pH = 1)清洗，接着依次用 去离子水、 1mol/L KOH 和去离子水清洗，然后用 10 mol/L EDTA 除去金属离子的污染，最后 用去离子水彻底清洗， 以后每次使用时， 可只用 0.5%的去污剂清洗， 然后用

14、自来水和去离子 水洗净即可。第三节 溶液的混匀搅拌与过滤一、溶液的混匀、搅拌与振荡 在生化实验中，每参加一种试剂后必须充分混匀，才能使反响充分进行；配制溶液时， 必须随时搅拌或进行振荡混合。常用的溶液混匀方法有以下 3 种。1搅拌式适用于烧杯内溶液的混匀。(1) 搅拌使用的玻璃棒，必须两头都烧圆滑。(2) 玻璃棒的粗细长短必须与容器的大小和所配制的溶液的量呈适当比例关系。不能用 长而粗的玻璃棒去搅拌小离心管中的少量溶液。(3) 搅拌时，尽量使玻璃棒沿着器壁运动，不搅入空气，不使溶液飞溅。(4) 倾入液体时， 必须沿壁器慢慢倾入， 以免大量空气混入。 倾倒外表张力低的液体 ( 如 蛋白质溶液 )

15、 时，更须缓慢仔细。(5) 研磨配制溶胶溶液时，要使杵棒沿着研钵的单方向进行，不要来回研磨。2. 旋转式适用于锥形瓶、容量瓶、大试管内溶液的混匀。(1) 振荡混合小离心管中液体时，可将离心管拿在手中，以手腕或肩作轴旋转离心管； 手指持管的松紧要适合振动的幅度。还可以把双手掌心相对合拢，夹住离心管，来回搓动。(2) 振荡溶液时，应沿着园圈转动容器，不应上下振荡。(3) 在容量瓶中混合溶液时，应倒持容量瓶摇动，用食指或手心顶住瓶塞，并不断翻转 容量瓶。(4) 在分液漏斗中振荡液体时，应用一手在适当斜度下倒持漏斗，用食指或手心顶住瓶 塞，并用另一只手控制活塞。一边振荡，一边翻开活塞，使气体可以随时从

16、漏斗排出。3. 弹打式适用于离心管、小试管内溶液较多不易作振摇时的混匀。 在离心管中混合液体时， 可由一手持离心管上端， 另一手手指轻拨试管底部， 使管内液 体作旋转流动；也可用一手拇指和食指持管的上端，用其余3 个手指弹动离心管、小试管。4. 振摇式 适用试管内少量液体的混匀。5. 倒转式 适用于具塞试管内有较多液体时以及容量瓶内液体的混匀。二、溶液的过滤 常用的溶液过滤的方法有以下几种：1. 普通漏斗过滤此法最为简便和常用。 过滤时先将滤纸对折叠成四层， 放在漏斗中， 滤纸的上缘应略低 于漏斗边缘并与漏斗壁完全吻合， 不留缝隙。 向漏斗内加液时， 要用玻棒引导不能过快倒入， 液面不能超过滤

17、纸的上缘。2. 布氏漏斗抽滤此法可加速过滤， 并使沉淀抽吸得较枯燥。 但不宜过滤胶体沉淀和颗粒太小的沉淀， 为胶体沉淀易穿透滤纸，颗粒太小的沉淀易在滤纸上形成一层密实的沉淀，溶液不易透过。过滤时用循环水真空泵使吸滤瓶内减压， 由于瓶内与布氏漏斗液面上形成压力差， 因而加快了过滤速度。第四节 实验样品的制备在生物化学实验中， 无论是分析组织中各种物质含量或是探究组织中物质代谢过程， 都 需要利用特定生物样品。 由于实验的特殊要求， 往往需要将获得的样品先作适当处理。 掌握 实验样品的正确处理与制备方法是做好生物化学实验的先决条件。一、血液样品1. 全血 实验用的全血是指抗凝全血。 取清洁枯燥的试

18、管或其他容器， 收集人或动物的新鲜血液， 立即与适量的抗凝剂充分混合。取得的全血如不立即使用，应置冰箱中储存。常用的抗凝剂有柠檬酸盐、草酸盐、氟化钠、肝素等，可根据实验要求而定。通常先将抗凝剂配成水溶液，按所取血量需要加到试管或其他适宜的容器中，横放，在100 C以下烘干肝素不宜超过 300C,那么抗凝剂在管壁上形成一层薄膜，使用时较为方便，效果也好。2. 血浆抗凝全血经离心机离心， 那么血细胞下沉， 上清液即为血浆。 用血浆分析必须严格防止溶 血，故在采血时所用的取血容器包括注射器、 针头与试管必须枯燥、清洁。 取出血液也不能 剧烈振摇，最好使用一次性注射器与试管，可防止医院内感染和有利于废

19、物的处理。3. 血清收集不加抗凝剂的血液， 在室温下自行凝固， 通常经 3 小时后血块收缩析出血清。 为促 使血清别离，可离心别离，这样可缩短时间，并取得较多的血清。制备血清也要防止溶血， 一方面器具要枯燥，另一方面，血块收缩后，及早别离出血清，因为放置过久，血块中的血 细胞可能溶血。4. 无蛋白血滤液许多生物化学分析需防止蛋白质的干扰， 常用蛋白质沉淀剂将其中的蛋白质去除， 制成 无蛋白血滤液，再进行分析。如尿酸、肌酸等物质的测定。常用的蛋白质沉淀剂有：钨酸、 三氯醋酸、硫酸锌及高氯酸等，可根据不同的需要而加以选择。、尿液样本24 小时尿液对尿液标本进行分析一般定性实验只需收集一次尿液，但定

20、量实验应收集 混合后取样。 24 小时尿液收集的方法通常在早晨一定时间排出剩余尿弃去，以后每次尿都 收集于清洁有盖容器中，到第二天早晨同一时间收集最后一次尿即为 24 小时尿。为防止尿液变质，须参加不影响实验的防腐剂，防腐剂应在收集第一次尿时同时参加。 常用的防腐剂有甲苯、盐酸等，用量为 5ml/L 。尿液样本收集后应立即分析，如不能及时分析，应将留取的尿液置40°C冰箱中保存。三、组织样本离体不久的组织，在适宜的温度及PH等条件下，可以进行一定程度的新陈代谢。 因此， 在生物化学实验中， 常利用离体组织研究各种物质代谢的途径与酶系的作用，也可以从组织中提取各种代谢物或酶进行研究。1

21、. 组织匀浆 新鲜组织称取重量后剪碎，参加适当的匀浆制备液，用高速电动匀浆器 或用玻璃匀浆器打碎组织制成组织匀浆。常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液、 Krebs-Ringer 氏溶液及 0.25M 蔗糖等，可根据实验的不同要求，加以选择。2. 组织浸出液 将上法制成的组织匀浆离心，其上清液即为组织浸出液。第五节 生物化学常用缓冲液一、常用缓冲液由一定物质所组成的溶液， 在参加一定量的酸或碱时， 其氢离子浓度几乎不变， 此种溶 液称为缓冲溶液， 这种作用称为缓冲作用， 其溶液内所含物质称为缓冲剂。 缓冲溶液通常是 一种弱酸及其共轭基团的混合物。生物化学常用缓冲液有以下几种：1. 磷酸盐缓冲液磷

22、酸盐H2PO4和HP02-是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有2个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽。酸性缓冲液：用 H2P04-, pH值为14。中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH值为68。碱性缓冲液：用 HPQ2-, pH值为1012。磷酸盐缓冲液的优点为：容易配制成各种浓度的缓冲液；适用的pH范围宽；pH受温度的影响小；缓冲液稀释后pH变化小，如稀释10倍后pH的变化小于0.1。其缺点为：易与常见的钙Ca2+、Mg+离子以及重金属离子缔合生成沉淀；会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化会产生某种程度的抑制作用。2 Tris 缓冲液Tris缓冲液在

23、生物化学研究中多用于电泳缓冲液。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中都使用Tris 缓冲液，而很少再用磷酸盐缓冲液。Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性范围，例如：TrisHCI缓冲液：pH 值为7.58.5Tris-磷酸盐缓冲液：pH 值为5.O9.0TrisHCI缓冲液的优点是：因为Tris的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系,配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。其缺点是：缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释10倍，pH值的变化大于0.1 ;温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，例如：4C时缓冲液的pH

24、值为8.4，贝U 37C时的pH值为7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的 Tris HCI缓冲液不能低于04C;易吸收空气中的 CQ,所以配制的缓冲液要盖严密封； 此缓 冲液对某些 pH 电极发生一定的干扰作用，所以要使用与 Tris 溶液具有兼容性的电极。3有机酸缓冲液这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH值范围为酸性，即pH值为3.06.0 ，最常用的是甲酸甲酸盐缓冲液、乙酸乙酸钠和柠檬酸柠檬酸钠缓冲体系。有机酸缓冲液的缺点是：所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反响过程可能发生干扰作用；柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子Fe3+、Zn2+、Mg+等结合而

25、使2+ 2+缓冲液受到干扰；这类缓冲液易与Ca离子结合，所以样品中有Ca离子时，不能用这类缓冲液。4 硼酸盐缓冲液常用的有效pH范围是：pH值为8.510.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其 优点是配制方便， 只使用一种试剂， 缺点是能与很多代谢产物形成络合物， 尤其是能与糖类 的羟基反响生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。5 氨基酸缓冲液此缓冲液使用的范围宽，可用于 pH值为2.011.0，最常用的有甘氨酸一 HCI缓冲液： pH值为2.05.0 ;甘氨酸一NaOHg冲液：pH值为8.011.0 ;甘氨酸-Tris 缓冲液：pH值 为 8.011.0。此类缓冲体系的优点是： 为细胞组分

26、和各种提取液提供更接近的天然环境。 其缺点是 与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反响过程；试剂的价格较高。二、缓冲溶液的选择选择缓冲液时， 要了解它的使用范围。 枸橼酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液很容易形成难溶 的二价阳离子复合物，磷酸盐可作为底物、某些酶的抑制剂或活化剂。这2种缓冲液都具有阳离子，如Na+或Ko Tris常常对生物体有毒，其具有高度脂溶性，能从完整细胞和别离的 细胞器中穿过，使电子传递解偶联。 此外，Tris容易受温度影响，当温度从4C升到37C时， 其川的浓度增加10倍。用于生物学实验的理想缓冲剂应具有以下特点：不能透过生物膜；具有生物学稳定性，且不干扰新陈代谢和

27、生物学过程； 对紫外线和可见光无明显吸收； 离子成分或盐浓 度对实验的影响较小；温度对其pH的影响极小。选择了适宜的缓冲液后，需要将溶液调节到所需要的 pH,必须考虑2个因素：到达准确pH所需酸和共轭碱的比例；缓冲液的需要量，缓冲能力依赖于酸和碱的绝对数量及其相对 比例。对于传统的缓冲液, 习惯上采用把酸性和碱性母液按比例混合的方法得到所需的pHo 对于具有两性离子的酸来说, 通常是把它先参加到水中, 然后参加一定量的强碱或强酸调解 pH 到所需。也可以通过滴加酸或碱，用 pH计检测pH,直到pH准确为止。三、pH值的测定测定溶液pH值通常有两种方法。1 pH 试纸法最简便但较粗略的方法是用

28、pH试纸，其分为广泛和精密 pH试纸两种。广泛 pH试纸的 变色范围是pH值为114、68、914等，只能粗略确定溶液的 pH值。另一种是精密 PH 试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是 23个PH单位并可以通过不同指示剂进行比对，例如有 pH值为4.07.0、8.010.0等多种，可根据待测溶液的酸、碱性选 用某一范围的试纸。测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸不可用手拿.以免污染试纸 ,用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触,试纸变色后与色阶板对照,估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测试纸要存放在有盖的容器中，

29、以免受到实验室内各种气体的污染。2 pH 计法精确测定溶液pH值要使用pH计，其精确度可达 0.005个pH单位，关键是要正确选用和校对pH电极。过去是使用两个电极，即玻璃电极和参比电极，目前已被淘汰，被两种电下端玻璃泡处有保极合一的复合电极所代替， 即将它们共同组装在一根玻璃管或塑料管内，护罩，使用十分方便，尤其是便于测定少量液体的pH 值。使用时应注意：(1) 经常检查电极内的 4molL KCl 溶液的液面，如液面过低那么应补充4mol L 的 KCl溶液。(2) 玻璃泡极易破碎，使用时必须极为小心。(3) 复合电极长期不用，可浸泡在2 mol / L的KCI溶液中，平时可浸泡在无离子水

30、或缓冲溶液中， 使用时取出， 用蒸馏水冲洗玻璃泡局部，然后用吸水纸吸干余水，将电极浸入待 测溶液中，稍加搅拌，读数时电极应静止不动，以免数字跳动不稳定，(4) 使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。(5) 使用前要用标准缓冲液校正电极，常用的 3 种标准缓冲液 pH 值 400、688 和9. 23(20 C)，精度为士 0. 002 pH单位。校正时先将电极放入6. 88的标准缓冲液中，用pH计上的“标准旋钮校正pH读数，然后取出电极洗净，再放人pH值为4. 00或9. 23的标准缓冲液中，用“斜率旋钮校正pH读数，如此反复屡次，直至二点校正正确，再用第三种标准缓冲液检查。现在，

31、有的pH计可以自动校正，按“ yes 确定即可，标准缓冲液不用时应冷藏。(6) 电极的玻璃泡容易被污染。假设测定浓蛋白质溶液的pH值时，玻璃泡外表会覆盖一层蛋白质膜，不易洗净而干扰测定，此时可用0.1 mol/L 的HCI和I mg /ml胃蛋白酶溶液浸泡过夜。假设被油脂污染，可用丙酮浸泡。假设电极保存时间过长，校正数值不准时，可将电极放入2 mol /L的KCI溶液中，40C加热1 h以上，进行电极活化。(7) 溶液 pH 值取决于溶液中的离子活度而不是浓度，只有在很稀的溶液中，离子的活度才与其浓度相等。 生化实验中经常配制比使用浓度高 10倍的“贮液 ，使用时再稀释到所需 浓度，由于浓度变

32、化很大，溶液pH会有变化，因而，稀释后仍需对其pH进行调整。(8) 有的缓冲液(如“ Tris )的pH值受温度影响很大，所以配制和使用都要在同一温 度下进行。第六节 生物化学实验室常用仪器的使用一、移液枪移液枪在生化实验中大量被使用， 它们主要用于量取少量或微量的液体， 可屡次重复地快速定量移液，并只用 1只手操作，十分方便。移液的准确度 (即容量误差 )为±( 0.5-1.5 %，移液的精密度即重复性误差更小些，w 0.5 %。移液枪可分为2种：一种是固定容量的，常用的有100 d等多种规格。每种移液枪都有其专用的聚丙烯塑料枪头吸头，枪头通常是一次性使用，当然也可以超声清洗后重复

33、使用，此种枪头还可以进行 121 C高温、高压灭菌。另一种是可调容量的移液枪，常用的有222 d、022 d和1222 d等几种。IF图2 2 可调移液器移液枪A :按钮拇指钮B :把手 C:手柄 D:按钮杆E:卸尖器 F:显示窗 G:卸尖器环H :吸头注：推动按钮内部的活塞分2段行程：第一档为吸液，第二档为放液，手感十分清楚。一移液枪的操作方法1. 量程的调节在调节量程时，用拇指和食指旋转移液枪上部的旋钮，使数字窗口出现所需容量体积的数字。如果要从大体积调为小体积，那么按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可；但如果 要从小体积调为大体积时，那么可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至

34、设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。在该过程中，不可将旋钮旋出量程，否那么会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。2. 枪头的装配在将枪头套上移液枪时，不可用力太大，因为这样会导致移液枪的内部配件如弹簧因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。正确的方法是将移液枪器垂直插入枪头中，稍微用力及左右微微转动即可使其紧密结合。如果是多道如8道或12道移液枪，那么可以将移液枪的第一道对准第一个枪头，然后倾斜地插入，往前前方向摇 动即可卡紧。枪头卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接局部形成清晰的密封圈。3. 移液移液之前，要保证移液枪、枪头和液体处于相同温度。四指并拢，握住移液枪

35、上部，并 使移液枪保持竖直状态， 然后用拇指按住柱塞杆顶端的按钮， 向下按到第一停点， 将移液枪 的枪头插入待取溶液中， 缓慢松开按钮， 吸上液体， 并停留秒 1-2粘性大的溶液可加长停留 时间 ，将枪头沿器壁滑出容器， 用吸水纸擦去吸头外表可能附着的液体， 排液 时枪头接触 倾斜的器壁，先将按钮按到第一停点，停留 秒 1 粘性大的液体要加长停留时间 ，再按压到 第二停点， 吹出枪头尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下枪头， 可按下除枪头推杆， 将枪 头推入废物缸。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿枪头 尤其是要吸取粘稠或密度与 水不同的液体时 。4. 放置使用完毕， 把移液枪的量程调至最大值

36、刻度， 使弹簧处于松弛状态，以保护弹簧。 然后 竖直挂在移液枪架上。 当移液枪枪头里有液体时， 切勿将移液枪水平放置或倒置， 以免液体 倒流，腐蚀活塞弹簧。二移液枪的维护保养1. 定期清洗移液枪可以先用肥皂水或 60%异丙醇清洗， 然后再用蒸馏水清洗， 自然晾干。 每天开始工作时， 检查移液枪外表 尤其是枪头 管嘴连件局部 是否有灰尘和污迹， 建议用 70%乙醇擦拭， 确 保清洁。如果移液枪每天都需要使用，那么建议每3个月清洁并校准 1次。可按说明书拆开移液枪，检查并擦拭灰尘和污迹。只能用70%乙醇擦拭，管嘴连件和推出器可浸泡在乙醇中过夜。活塞、C形环和弹簧涂上硅油后装上，并复原移液枪。2.

37、高温、高压消毒管嘴在121 C高温、高压20min后，放置在常温或烘箱中，待水气蒸发后再使用。整支Focus 和Digital移液枪、Freshma n和彩色移液枪的管嘴连件，以及电子移液枪的管嘴连件，也按 121 C高温、高压20min的条件消毒。消毒后的移液枪必须放置在室温2小时前方可使用，并且需要进行校准。、3. 校准在20-25 C环境下，通过重复几次秤量蒸馏水的方法进行。用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算，来校正移液枪，1ml蒸馏水20 C时重0.9982g。4. 漏液的检查使用时要检查是否有漏液现象， 方法是吸取液体后悬空垂直放置数秒钟， 看看液面是否下降。如果漏液，原因大致有

38、以下几方面：枪头不匹配，弹簧活塞老化，液体易挥发。如果是最后一种情况，可以先吸放数次液体，然后再移液。三移液枪使用考前须知1 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而 冲入移液枪内腐蚀柱塞，而造成漏气。2浓度和粘度大的液体，会产生误差。为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿 量可通过调节旋钮、改变读数窗的读数来进行设定。3可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1ml蒸馏水20C时重 0.9982g。4 在设置量程时，请注意旋转到所需量程数字清清楚楚在显示窗中，所设量程应在移液器量程范围内，不要将旋钮旋出量程，否那么会卡住机械装置，损坏了

39、移液枪。5 严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体如浓酸、浓碱、有机物等。一般常用的移液枪只适用于量取水溶液，如生物缓冲液、培养液等。6 严禁使用移液枪吹打混匀液体。7不要用大量程的移液枪移取小体积的液体，以免影响准确度。同时，如果需要移取 量程范围以外较大量的液体，请使用吸管进行操作。二、电热恒温水浴箱电热恒温水浴箱用于恒温、加热、消毒及蒸发等。常用的有2孔、4孔、6孔和8孔，工作温度从室温至100 C。 如图图2 3电热恒温水浴箱一使用方法1 关闭水浴箱底部外侧的放水阀门，向水浴箱中注入蒸馏水至适当的深度。加蒸馏水而不是自来水是为了防止水浴箱体 铝板或铜板被侵蚀。2 将电源插头接在插座上，合上

40、电闸。插座的粗孔必须安装接地线。3将调温旋钮沿顺时针方向旋转至适当温度位置。4翻开电源开关，接通电源，红灯亮，表示电炉丝通电开始加热。5. 在恒温过程中，当温度升到所需的温度时，沿逆时针方向旋转调温旋钮至红灯熄灭、绿灯亮为止。此后，红绿灯就不断熄、亮，表示恒温控制发生作用。6调温旋钮刻度盘的数字并不表示恒温水浴箱内的温度。随时记录调温旋钮在刻度盘上的位置与恒温水浴箱内温度计指示的温度的关系。在屡次使用、总结经验的根底上， 可以比拟迅速地调节，得到需要控制的温度。7使用完毕，关闭电源开关，拉下电闸，拔下插头。&假设较长时间不使用，应将调温旋钮退回零位，并翻开放水阀门，放尽水浴箱内的全 部

41、存水。二考前须知1 水浴箱内的水位绝对不能低于电热管，否那么电热管将被烧坏。2控制箱内部切勿受潮，以防漏电损坏。3. 初次使用时，应参加与所需温度相近的水后再通电，并防止水箱内无水时接通电源。4使用过程中应注意随时盖上水浴槽盖，防止水箱内水被蒸干。5 .调温旋钮刻度盘的刻度并不能精确表示水温，实际水温应以温度计读数为准。三、电动离心机在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，有过滤和离心2种方法。在下述情况下，使用离心方法较为适宜：沉淀有粘性；沉淀颗粒小，容易透过滤纸；沉淀量多而疏松；沉淀量少，需要定量测定；母液量很少，别离时应减少损失；沉淀和母液必须迅速别离开；母液粘稠；一般胶体溶液。离心机是利用离

42、心力对混合物溶液进行别离和沉淀的一种专用仪器。电动离心机通常分为大、中、小3种类型。图2 4 电动离心机一离心原那么：1. 平衡：将一对离心管放入一对套管中，置于天平两侧，用滴管向较轻一侧的离心管 与套管之间滴水至两侧平衡。2. 对称：将已平衡好的对管置于离心机中的对称位置。一使用方法 1离心前检查：取出所有套管，起动空载的离心机，观察是否转动平稳；检查套管有 无软垫，是否完好，内部有无异物；离心管与套管是否匹配；检查变速旋钮是否在“0处。2离心时先将待离心的物质转移到大小适宜的离心管内，盛量占管的2/3 体积， 以免溢出。将此离心管放入外套管内。3将1对外套管 连同离心管 放在台秤上平衡，

43、如不平衡， 可用小吸管调整离心管内容 物的量或向离心管与外套间参加平衡用水。 每次离心操作都必须严格做到， 否那么将会损坏离 心机部件，甚至造成严重事故，应十分警惕。4将以上 2个平衡好的套管，按对称位置放到离心机中，盖严离心机盖，并把不用的离心套管取出。5开动时，先开电源开关，然后慢慢拨动变速旋钮，使速度逐渐加快。停止时，先将旋钮拨到“ 0，不继续使用时，拔下插头。待离心机自动停止后，才能翻开离心机盖并取 出样品，绝对不能用手阻止离心机转动。6用完后，将套管中的橡皮垫洗净，保管好。冲洗外套管，倒立使其枯燥。 二考前须知1离心过程中，假设听到特别响声，说明离心管可能破碎，应立即停止离心。如果管

44、已 破碎， 将玻璃渣冲洗干净 玻璃渣不能倒入下水道 ，然后换管按上述操作重新离心； 假设管未 破碎，也需要重新平衡后再离心。2有机溶剂和酚等会腐蚀金属套管，假设有渗漏现象，必须及时擦干净漏出的溶液，并 更换套管。3. 防止连续长时间使用。 一般大离心机使用 40min后应休息20min或30min ,台式小离心 机使用40min后休息10min。4. 电源电压与离心机所需的电压一致，接地后才能通电使用。5. 应不定期检查离心机内电动机的电刷与转子磨损情况，严重时更换电刷或轴承。四、紫外-可见分光光度计人们在实践中早已总结出不同颜色的物质具有不同的物理和化学性质。根据物质的这些特性可对其进行有效

45、的分析和判别。1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外-可见分光光度计。此后，紫外-可见分光光度计经不断改良，又出现自动记录、自动打印、数字显示、 微机控制等各种类型的仪器， 使分光光度法的灵敏度和准确度不断提高，应用范围不断扩大。目前，分光光度法已为工农业各个部门和科学研究的各个领域广泛采用，成为人们从事生产和科研的有力测试手段。 我国在分析化学领域有着坚实的根底，在分光光度分析方法和仪器的制造方面都已到达一定的水平。现以VU-9200型紫外可见分光光度计为例，介绍紫外-可见分光光度计的使用方法。图2 5 紫外可见分光光度计一仪器各局部功能介绍1 样品室门翻开门可放置样品，关上门后才可以进

46、行测量。2 显示窗显示测量值。在不同的功能下，可以分别显示透射比、吸光度及浓度和错误显示。3.波长显示窗显示当前波长值。4.波长调节旋钮调节波长用，当转动波长旋钮时，显示窗的数字随之改变。5.仪器电源开关。6.仪器操作键盘实现仪器测量及功能转换。7.打印输出口&RS232口 选配。9.换灯手柄。10.样品池拉手11 .电源插座。12氘灯开关。(二) 操作步骤安装好仪器后， 检查样池位置， 使其处在光路中 ( 拉动拉手应感到每档的定位 )。关好样 品室门， 翻开仪器电源开关 (假设联用打印机， 那么应先开主机后再开打印机 ) ，方式选择指示灯 应在透射比位置，工作曲线选择点应在第一点，显

47、示器应显示为XX .X ，预热 10 min ，即可以进行测量。1. 透射比测量在样品室中，放置空白及样品 。(1) 按需要调节波长旋钮，使波长显示窗显示所需波长值。(2) 按 方式选择 键使透射比指示灯亮，并使空白溶液处在光路中。(3) 按100环键调100%，待显示器显示100.0时即表示调好100T。(4) 翻开样品室门在样池架中放挡光板，关闭样品室门，观察显示器是否为零，如不为22,那么按0环调零。(5) 取出挡光板，放入空白溶液，关好样品室门，显示器应为 100.0，假设不为 100.0那么重 新调100勿(重复)。(6) 拉动样品拉手使被测样品依次进入光路，那么显示器上依次显示样品

48、的透射比值。2. 吸光度测量 吸光度测量与透射比根本相同，只是有一点要注意，按方式选择键时，应使吸光度ABS指示灯亮。(三) 使用比色皿时考前须知1 拿比色皿时，手指只能捏住比色皿毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。 2应将比色皿的透光面对准光路，切勿将毛玻璃面对着光路。3测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液清洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶 液的浓度。 在测定一系列溶液的吸光度时， 通常都按由稀到浓的浓度顺序测定， 以减小测量 误差。4清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液 (体积比 1:2) 浸泡片刻， 再用水冲洗。 不能用碱溶

49、液或氧化性强的洗涤 液洗比色皿， 以免损坏； 也不能用毛刷清洗比色皿， 以免损伤它的透光面。 每次做完实验时， 应立即洗净比色皿。5比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。第七节常用的生物化学实验方法一、分光光度法分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱对物质进行定性或定量分析的一项技术。它具有灵敏度高、操作简便、 快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测 定都采用分光光度法。一原理光的本质是一种电磁波，具有不同的波长。肉眼可见的光称为可见光， 波长范围在400 760nm波长v 400 nm的光称为紫外光，波长 760 nm的光称为红外光。可见光区的光因波 长不

50、同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的光称为单色光。单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光。 可见光区的单色光按波长顺序排列为：红、橙、黄、绿、青、蓝、紫。许多物质的溶液具有颜色，有色溶液所呈现的颜色是由于溶液中的物质对光的选择性吸收所致。不同的物质由于其分子结构不同， 对不同波长光的吸收能力也不同， 因此具有其 特有的吸收光谱。即使是相同的物质由于其含量不同， 对光的吸收程度也不同。 利用物质所 特有的吸收光谱来鉴别物质或利用物质对一定波长光的吸收程度来测定物质含量的方法，称为分光光度法。所使用的仪器称为分光光度计。朗伯一比尔Lambert Beer定律是分光光度法的根本原理。当一束单色

51、光通过一均匀的溶液时，一局部被吸收，一局部透过，设入射光的强度为10,透射光强度为I，那么丄1 0 为透光度，用T表示。当溶液的液层厚度不变时，溶液的浓度越大，对光的吸收程度越大，那么透光度越小。即：-IgT =KC 式中K为吸光系数，C为浓度当溶液浓度不变时，溶液的液层厚度越大，对光的吸收程度越大，那么透光度越小。即：- lg T = K “ L L为液层厚度将以上两式合并可用下式表示:-IgT 二 K C L研究说明：溶液对光的吸收程度即吸光度A又称消光度 E或光密度 0D与透光度T呈负对数关系，即A =lgT故A = KCL上式为朗伯一比尔定律，其意义为：当一束单色光通过一均匀溶液时，溶

52、液对单色光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度的乘积呈正比。朗伯一比尔定律常被用于测定有色溶液中物质含量，其方法是配制浓度的标准液S，将待测液 T与标准液以同样的方法显色，然后放在厚度相同的比色皿中进行比色，那么:测定其吸光度,得AS和 A，根据朗伯一比尔定律：AS=KsCs LsAt = KtCt Lt两式相除得：ASKSCSLSATKT CT LT由于是同一类物质其K值相同，又由于比色皿的厚度相等，所以Ks二Kt , Ls = 1AS _ CSATCTCtCsAs此即Lambert-Beer定律的应用公式。二应用利用分光光度法对物质进行定量测定主要有以下几种方法: 1 标准管法A值，然后按下式求

53、得待测溶将待测溶液与浓度的标准溶液在相同条件下分别测定 液中物质的含量。Ct 二学 Cs2. 标准曲线法先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测定出它们的 A值，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线。在测定待测溶液时，操作条件应与制作标准曲线时相同，以待测 液的A值从标准曲线上查出该样品的相应浓度。3 吸收系数法当某物质溶液的浓度为 1mol/L，厚度为1cm时，溶液对某波长的吸光度称为该物质的 摩尔吸光系数，以 £表示。£值可通过实验测得，也可由手册中查出。某物质£值，只要测出其A值再根据下式便可求得样品的浓度。722型分光光度计为例说明。(三) 分光光度

54、计分光光度计种类较多，其结构根本相似，以图2-6 722型分光光度计1 仪器的构造(主要部件)(1) 光学系统采用光栅自准式色散系统和单光束结构光路，如图27所示。(2) 仪器的结构722型分光光度计的主要部件包括光源室、单色光器、试样室、光电池暗盒、电子系统及数字显色器等部件。 光源室部件 由钨灯灯架、聚光镜架、截止滤光片组架等部件组成。钨灯灯架上装 有钨灯，作为可见区域的能量辐射源。 单色器部件是仪器的心脏局部，位于光源与试样室之间。由狭缝部件、反光镜组件、准直镜部件、光栅部件与波长线性传动机构等组成。在这里使光源室来的白光变成单色光。 试样室部件 由比色皿座架部件及光门部件组成。A值或T

55、、c值。 光电管暗盒部件 由光电管及微电流放大器电路板等部件组成。由试样室出来的光经 光电转换并放大后，在数字显示器上直接显示出测定液的图2-7 722型光柵分光光度计外观示意图1. 数字显示器；2吸光度调零旋钮消光零；3选择开关；4.吸光度调斜率电位器；5.浓度旋钮；6.光源室；7.电源开关；8.波长旋钮；9.波长刻度窗；10.试样架拉手;11. 100%T旋钮；12. 0%T旋钮0旋钮；13.灵敏度调节旋钮；14.枯燥器2.工作过程如图2-7所示：由钨灯发出的连续辐射光经滤色片选择及聚光镜聚光后经入射光狭缝进入单色光器，进入单色光器的复合光通过平面反射镜反射及准直镜准直变成平行光射向色散元件光栅，光栅将入射的复合光通过衍射作用形成按照一定顺序均匀排列的连续单色光谱，此单色光重新回到准直镜上，由于仪器出射狭缝设置在准直镜的焦面上，这样从光栅色散出来的光谱经准直镜后利用聚光原理