生物工程综合实验

1、生物工程综合大实验木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，其化学结构较纤维素复杂得多，它是一个以-1,4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基如乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的。Endo-1,4-木聚糖内切酶（EC .8）简称木聚糖酶，是木聚糖降解过程中最关键的一个酶，也是被研究最多的一个半纤维素酶，随机水解木聚糖主干链内部的-1,4-糖苷键，产生木寡糖、木二糖和少量木糖。木聚糖酶在造纸工业、饲料工业、食品工业、低聚木糖的制备等领域具有重要应用价值。本实验主要以携带有编码极端耐热木聚糖酶基因的重组质粒的大肠杆菌工程菌（JM109-pHsh-xynB）

2、为对象，利用它进行重组酶的发酵生产和分离纯化。通过此次实验，希望同学们能对微生物发酵产酶的一般过程、酶活性的测定、酶的提取和分离纯化有一个基本的认识和了解。实验一 木糖-吸光度标准曲线、蛋白质浓度-吸光度标准曲线制作在研究酶的性质、酶的发酵生产、分离纯化和应用中需要经常测定酶的活性，为了较准确的表示酶活力，必须建立一种简便灵敏的酶活性测定方法。在酶的分离纯化和酶学性质研究中，经常要测定酶蛋白质的含量。Bradford法是一种迅速可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。1、实验目的掌握木糖标准曲线和Bradford标准曲线的制作方法2、实验原理木聚糖酶的活性通常是测定其水解底物木聚糖后生成的

3、产物的还原末端木糖的增加量来进行的，而木糖的含量可以利用其与某些显色试剂（如DNS试剂，PAHBAH）反应后生成在特定波长下有特异吸收峰的有色化合物，从而通过分光光度法测出。本实验中，木聚糖酶活性的测定是以0.5%燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）与水解反应产生的还原糖反应生成的化合物在沸水浴中显现出黄色，这种化合物在410 nm有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与产物还原糖的多少有关，因此可检测410nm的光吸收值的大小计算酶活。用分光光度法测定木聚糖水解产物还原糖的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出还原糖的含量，最后根据产物的含量就可以计算出酶的活性。因此，制作

4、标准曲线是酶活性测定的一项基本技术。Bradford法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速稳定，反应化合物在465595nm有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白质的含量。同样，测定某一种蛋白质的浓度时，也要先用已知浓度的一种蛋白质制作标准曲线，然后根据标准曲线查出待测蛋白质的浓度。3、试剂标准木糖溶液：准确称取经105烘至恒重的无水木糖1g,用蒸馏水定容至100ml(即1%)，实际应用时稀释到0.01%邻苯二甲酸氢钾

5、缓冲液： 准确配制0.1 M pH5.8 (90) 的邻苯二甲酸氢钾缓冲液 500 ml，利用pH计以NaOH调节到规定铺pH值终止剂/显色剂PAHBAH：A: 0.5 M HCl溶解的5%（w/v）对羟基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoic acid）200 ml，配好后储藏于4冰箱B: 0.5 M NaOH 1 L使用时，将A与B按1：4的体积比混合即为PAHBAH显色剂Bradford 储存液：100 ml 95%乙醇，200 ml 85%磷酸，350mg 考马斯亮蓝G-250可在室温下长期保持稳定Bradford 工作液：425 ml双蒸水，15 ml 95%乙醇，30 ml

6、85%磷酸，30 ml Bradford 储存液滤纸过滤后保存于室温棕色瓶中标准蛋白质溶液:以牛血清白蛋白(BSA )作为标准蛋白，配制成1 mg/ml 标准溶液，用时可稀释。4、器材分光光度计、电子天平、水浴锅、煮沸电炉、移液管、泡沫浮子若干、pH计、磁力搅拌器冰水5、实验步骤：A. 木糖标准曲线的制作木聚糖酶活性的测定是以0.5% 燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色，具体方法是：反应体系为600µl，添加15 µl酶液到由300 µl 0.5%（w/v）燕麦木聚糖和285 µl 100 mM

7、 pH 5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液组成的已经在90下预热的混合液中，90下保温10 min后，最后加入1.8 mL终止剂/显色剂PAHBAH终止反应。其混合物在沸水浴中加热10 min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410 nm下测其吸收值。木聚糖酶活性单位定义为每分钟催化产生1 µmol木糖所需的酶量。在制作木糖标准曲线时，整个体系组成也应该与实际测定酶活性的条件一致。具体地说，在配制标准曲线时，整个体系应为：0.6 mL溶液（ 0.3 mL100 mM pH 5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液+ x mL 木糖溶液+(0.3-x) mL 无菌水）+ 1.8 mL终止剂/显色剂PAH

8、BAH。其混合物在沸水浴中加热10 min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410 nm下测其吸收值。 将适量 100 mM pH 5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液与标准木糖溶液（0.01%）、无菌水三者混合均匀，保证整个体系的总体积为600 µl，通过控制加入木糖溶液的体积量来调整混合液中木糖的量。每次得到的600µl混合液与1.8 mL的PAHBAH试剂混匀后，在沸水浴中加热10 min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410 nm下测定吸光度。以600µl混合液里不含标准木糖溶液的为空白对照。0.01%木糖（µl）3050801001201501802

9、00H2O(µl)270250220200180150120100缓冲液(µl)300300300300300300250200PAHBAH(mL)1.81.81.81.81.81.81.81.8A410A410平均值 以A410为纵坐标，木糖的量（mmol）为横坐标（尽量选取吸光度在0.10.8之间的点），在Excel上绘制标准曲线，经线性回归后得到A410-木糖(mmol)的标准曲线，既：即A410 nm= a x + b, x为木糖 (mmol)，一般相关系数R2值应在0.99以上，至少小数点后两个9。BBradford法测定蛋白质浓度标准曲线的制作 按下表将标准蛋白

10、质溶液小牛血清白蛋白转移到试管中，补加水至终体积300µl，加入3ml Bradford工作液并振荡混匀，在2min后测定A595值，测量应在1h内完成。样品号标准溶液（0.2mg/ml BSA）/mlH2O (ml)Bradford试剂（ml）A595空白对照030030150250350250350250321002003100200310020033150150315015031501503420010032001003200100352505032505032505036300033000330003以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在Excel上绘制标准曲线，经

11、线性回归后得到A595-蛋白质含量(mg)的标准曲线，既：即A595 nm= a x + b, x为蛋白质量 (mg)，一般相关系数R2值应在0.99以上，至少小数点后两个9。六、注意事项： 做木糖标准曲线时，要保证所有样品液同批次煮沸显色，以尽量避免不同批次的误差。 称取各种标准品要准确。Bradford法测定后玻璃比色皿容易染上颜色，用后可先用甲醇清洗，然后用水或丙酮清洗，或在浓HCl中浸泡过夜(或者用硫酸清洗)。 实验二、重组菌发酵产酶过程监测1、实验目的了解重组菌发酵产酶原理和过程，掌握重组菌生长过程监测和无菌取样技术。2、实验原理 通过基因重组技术可以使外源基因在大肠杆菌（Esche

12、richia coli）中得到大量表达主要是因为：E.coli携带的表达载体上通常都有一个强的启动子，这样启动子控制下的外源基因能够得到很高的表达量；同时，表达载体通常在细胞中是多个拷贝，这样使得外源基因在细胞的基因剂量也大大增加，从而也能够是目的基因的表达量增加。通常一个外源基因在E.coli中表达时，细胞内的大部分物质被用来产生外源基因的产物，这样细胞本身用于自身生长繁殖的营养很大部分被占夺，最终导致E.coli细胞的生长明显受到抑制，表现为最终生长密度不高，目的蛋白产量不高，为了克服这一缺陷，一般的做法是使表达载体上控制外源基因转录的启动子是可以控制的，也就是说在细菌生长的初始阶段，让其

13、积累较多的菌体，此时表达载体上的启动子不表现出转录活性或者活性非常低，当细胞长到一定浓度后，改变一定的外界环境后（如添加某种物质或培养条件改变），启动子的活性抑制被解除，此时外源基因便大量转录表达，最后目的基因编码的产物能够得到很高的产量。重组大肠杆菌（E.coli）生产木聚糖酶的途径为：重组E.coli携带有重组质粒pHsh-xynB,xynB基因是来源于极端嗜热厌氧菌海栖热袍菌（thermotoga maritima）的编码木聚糖酶的一个基因，pHsh是一种新型的大肠杆菌表达载体，其上有来源于根据E.coli热休克基因启动子保守序列设计而成的独特新型热激启动子Hsh promoter，当重

14、组菌在30生长时，热激启动子Hsh promoter对它下游的目的基因xynB的转录活性非常低，这样重组菌能够快速地生长到一个较高的细胞密度，当细胞生长到对数期（OD600=0.61.0）早期时，通过快速提高生长温度到42（即热激方式）使得热激启动子Hsh promoter的活性抑制得到解除。此时编码木聚糖酶的基因xynB就开始大量表达。同时，该表达载体的复制子使得xynB基因在E.coli中有很高的拷贝数，拷贝数可以达到500600个细胞，这样使得目的基因能在E.coli中达到很高的表达量。重组菌中木聚糖酶的活性随发酵时间不断发生变化，可以通过定时取样监测它的产酶过程。定时取样测定重组菌的细

15、胞密度OD600，重组菌的酶活随着细胞密度的增加不断增加，当细胞密度达到比较稳定的值时，由于木聚糖酶对应的mRNA的稳定性很高，所以在以后持续的几个小时，酶活仍然持续的增加，当酶活性开始下降时终止发酵。3、实验材料和设备A. 菌种大肠杆菌E. coli JM109（pHsh-xynB）携带有重组质粒pHsh-xynBB. 培养基重组大肠杆菌的培养基采用LB培养基：液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15 g/L。灭菌前调pH到7.07.5左右，两种培养基最后都要加氨苄青霉素至

16、终浓度100 mg/mL。C. 实验设备分光光度计，台式离心机，离心机，离心管若干（50-100 mL/支），超净工作台，可以控温的摇床，无菌移液管，三角瓶（需要1 L、100 mL、500 mL各若干），1.5 mL小塑料管，无菌水 4、实验步骤 种子培养实验前一天用重组质粒pHsh-xynB新鲜转化大肠杆菌E. coli JM109获得重组菌，晚上待菌落肉眼可见后，挑取单菌落接种于30ml 加有氨苄青霉素的LB培养基，在30下200rpm振荡培养过夜。 发酵流程次日以1%2%接种量接入到新鲜的含氨苄青霉素的LB培养基中，于30下培养至细胞到达对数期早期（OD600值大概为0.70.8）时，

17、将装有重组菌的三角瓶移入42摇床中，以此时为0时刻计时，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h使用无菌操作取样测OD600值，并各保留1ml样品离心收集细胞，用无菌水洗细胞一次，用1ml的无菌水重新悬浮后保存于-20用于次日酶活性测定。10h发酵结束后，将剩下的发酵液全部离心收集细胞，用无菌水洗涤一次，再次离心细胞后放置于-70用于重组酶的纯化。实验三、重组菌细胞破碎及酶活检测1、实验目的掌握超声波细胞破碎方法及木聚糖酶活性测定方法2、实验原理超声波是指频率超过人耳可听范围(1621kHz)的波，即频率为20kHz以上的波。微生物细胞在超声波的作用下，细胞结构受到破坏，而使细胞破碎。超声波

18、进行细胞破碎的效果与微生物的种类、浓度、超声波频率、输出功率和破碎时间有密切关系。使用超声波必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。木聚糖酶的活性通常是测定其水解底物木聚糖后生成的产物的还原末端木糖的增加量来进行的，而木糖的含量可以利用其与某些显色试剂（如DNS试剂，PAHBAH）反应后生成在特定波长下有特异吸收峰的有色化合物，从而通过分光光度法测出。3、实验材料和设备A. 试剂测定酶活用试剂：在实验一已配制0.5 %燕麦木聚糖：0.5木聚糖溶于100 mL无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌使之呈均一的悬浮液，加终浓度0.02%的叠氮化钠防止微生物生长。 8X Binding

19、buffer：40 mmol/L 咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.9B实验设备分光光度计、水浴锅、pH计、冰、烧杯、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、移液管、磁力搅拌器、超声破碎仪、高速离心机、离心管4、实验步骤 取前日分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h所取的1mL样品及用适量1X Binding buffer悬浮的10h发酵结束后的细胞（由100 ml发酵液离心来的细胞用4 ml 1X Binding buffer重悬），室温溶化后，用超声波破碎仪破碎细胞。1mL样品的超声条件为：50 Hz超声15s,间隔10 秒，如此多

20、次即可。用1X Binding buffer悬浮的细胞次数应该适当延长，当溶液变清即可停止。 破碎后的样品在12000g，4离心20min，弃沉淀。1mL的样品用来检测酶活性，用1X Binding buffer悬浮的细胞样品次日用于酶的纯化，此时放置于-70保存。 0h、1h、4h、6h、8h、9h、10h时的样品中木聚糖酶活性的测定：记录好各个取样点时测得的数据，将其代入实验一所得标准曲线方程中后算出每ml发酵液的酶活性。注意：每个时刻的样品需做三次平行，所有平行样品应该一批次同时做完，以减小不同批次实验引起的误差；酶液可能要适当经过稀释，以使最后读出的A405值在0.11之间，正式实验前

21、应该做预实验摸索好稀释倍数。实验四、重组木聚糖酶的纯化1、 实验目的掌握His-tag亲和层析柱纯化蛋白的方法2、 实验原理由xynB基因编码的木聚糖酶有很高的热稳定性，在90下保温2h，仍然有90%的活性，基于这一点，我们可以先用加热的方法除去酶液中的大部分不耐热的杂蛋白。蛋白质表面的某些氨基酸残基如：组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团（后两种与金属离子的作用要小得多），可与金属离子亲和结合。用螯合剂可以将金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+）螯合到母体。洗脱时，可以通过改变盐的浓度等降低金属离子与蛋白质的亲和力将其洗脱。经典的如组氨酸标签-镍离子亲和柱子（His

22、-tag）：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。洗脱的时候用高浓度的咪唑将蛋白洗下。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段。在xynB基因编码的C端，我们引物的编码六个组氨酸的CAC 密码子，使得重组酶带上组氨酸标签。3、实验材料和设备A. 试剂Ni-NTA亲和层析介质5ml8X Binding buffer：40 mmol/L 咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH 7.9 T

23、ris-HCl ，最终pH调到7.94X Elute buffer：4 mol/L咪唑，2 mol/L NaCl, 80 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.98X Charge buffer：400 mmol/L NiSO48X Wash buffer：480 mmol/L咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.94X Strip buffer：400 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl, 80 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.9B.实验设备移液管、试管

24、、分光光度计、pH计、控温水浴锅、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、铁架台4、实验步骤 热处理：将样品装入洗干净的玻璃试管中，在70水浴锅中保温30min，然后18000g离心4离心30min除去杂蛋白。his-tag亲和柱处理取1mL Ni-NTA亲和层析介质填料装柱（根据说明书上填料的吸附能力和样品的多少使用适当体积的填料），接着用3倍柱体积的无菌水洗柱子，再用5柱体积的1X Charge buffer洗柱子，再用3柱体积的1X Binding buffer洗柱子。上样样品上样前，取出少量样品作为后面的SDS-PAGE实验用。把样品加入柱子，用10柱体积的1X Binding buffer洗柱子，接

25、着用6柱体积的1X Wash buffer洗柱子，然后用6柱体积的1X Elute buffer洗脱柱子，此时注意用干净的EP管分部收集洗脱液。洗脱完后用1X Strip buffer洗柱子。 对上述收集的洗脱液测定木聚糖酶活，得到较高酶活的部分合并，并留出少量样品作为后面的SDS-PAGE实验用，余下样品在-20保存备用。实验五、纯化酶的电泳检测及比酶活测定1、实验目的学会采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析基因工程产物和蛋白质的纯度鉴定及测定酶的比酶活2、实验原理SDS-PAGE电泳是主要用来测定蛋白质分子量大小及纯度分析的技术。如果在PAGE系统中加入十二烷基硫酸钠(S

26、DS)，则蛋白质的迁移率主要取决于其分子量的大小，而与蛋白质所带的电荷和形状无关。SDS是阴离子去污剂，它能与蛋白质的疏水部分结合，并能把大多数的蛋白质分子拆分成亚基形式。由于大多数蛋白质与SDS结合的摩尔比为1.4：1，结合量很大，因此，加人SDS增加了蛋白质表面的负电荷，屏蔽了没有SDS时正常存在的任何一种电荷。SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化，使得雪茄形状的蛋白质分子的轴比发生改变。在巯基乙醇的作用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴趋于一致，长轴与分子量成正比。因此，它们的电泳速度不取决于电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。目前较流行的SDS-PAGE使用的都是线性垂

27、直薄板状胶，这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。由于薄片胶可在同一胶上跑很多样品，使聚合、染色脱色具有一致性，所以薄片胶比管状胶的应用更广泛，本实验是按照Bio-rad的小凝胶系统来设计的，这些步骤也适用于其他系统。经过亲和层析和加热纯化后，重组木聚糖酶应该在SDS胶片上显示出一个单一的条带，分子量应该与预期的一样，为40 kDa左右。同一个酶在相同的测定条件下，如果比酶活越高，则表示该酶的纯度越大，本实验中的木聚糖酶经过了亲和层析和加热两步纯化后，比酶活应该逐渐升高，且经过亲和层析后和加热后的比酶活相差不大。3、实验材料和设备A. 试剂丙烯酰胺（电泳级）双丙烯酰胺（N,N-甲叉

28、双丙烯酰胺）Tris碱SDS (十二烷基磺酸钠，分析纯)TEMED过硫酸铵甘氨酸B. 工作液：A液: 丙烯酰胺储存液，100ml 30% (w/v) 丙烯酰胺，0.8% (w/v)双丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒剂，操作时必须戴手套29.2 g丙烯酰胺0.8 g 双丙烯酰胺加蒸馏水溶至100 ml，棕色瓶4保存B液：4分离胶缓冲液，100ml75ml 2 mol/l Tris-HCl(pH 8.8)4ml 10% SDS21ml 蒸馏水可在4存放数月C液：4堆积胶（浓缩胶）缓冲液，100 ml50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)4ml 10% SDS

29、46ml 蒸馏水可在4存放数月10%过硫酸铵，5ml0.5 g过硫酸铵5ml 蒸馏水可在密封的管内，4存放数月电泳缓冲液：1L3g Tris 碱14.4g 甘氨酸1g SDS加蒸馏水至1LpH 应该在8.3左右，在室温下长期保存5样品缓冲液，10ml0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)5ml 50%甘油2ml 10% SDS0.5ml 2-巯基乙醇1ml 1% 溴酚蓝0.9ml 的蒸馏水可在-20保存数月C. 实验设备蛋白质电泳装置（垂直板蛋白电泳仪和电源）电源(电压200V，电流500mA)100沸水浴移液枪摇床1.5 mL小所料管4、实验步骤待检测的蛋白质分子量的大

30、小决定了所使用的分离胶的浓度，下面为不同浓度的分离胶的分离范围：丙烯酰胺在凝胶中的百分比 分离胶的范围 15% 1545kDa 12.5% 1560kDa 10% 1875kDa 7.5% 30120kDa 5% 60212kDa制胶所需时间：制分离胶 60min制堆积胶 30min上样 15min电泳 45min染色（考马斯亮蓝染色） 1h完全脱色 812hX%分离胶的计算：A液 x/3mlB液 2.5ml蒸馏水 （7.5- x/3）ml10%过硫酸铵 50mlTEMED 5ml总量 10ml灌制分离胶A.将玻璃板洗干净，烘干或者自然风干，装配好灌胶的模具，关键是确保凝胶玻璃板和垫片的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。B.将A液、B液在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺是神经毒素，操作时必须戴手套。C.加