北航生物医学工程学院 北京生物医学工程

1、北航生物医学工程学院 北京生物医学工程 维普资讯 :/ cqvip 第 卷 第 期 年 月 北 京 生 物 医学 工 程 双向凝胶 电泳在临床血浆蛋 白质组学研究中的技术难点和解决方法罗 小 云 吴 庆 华中 图 分 类 号 文献标识码 文章 编 号 随 着 双 向 电 泳 技 术 中 固相 化 梯 度 的 发 明 、 电 喷 雾 质 谱 、基 质辅 助 激 光 解 析 电 离 飞 行 时 间 质 谱 技 术 的 应 用 ， 蛋 白质 组 学 技 术 已 经 越 来 越 多 的 应 用 于 疾 病 的 研 究 中 。 临 临 床 血 浆 蛋 白质 组 研 究 的 难 点 浆 蛋 白质 组 成

2、分 种 类 繁 多 血床蛋 白质 组 学 已经 成 为 目前 医 学 研 究 中 的 热 点 。 血 液 标 本 因取 材 简 便 、应 用 价 值 高 ， 因此 血 浆 蛋 白质 组 学 最 具 有 应用 前 景 ，并 成 为 临床 蛋 白质 组 学 研 究 中关 注 的 重 要 问题 。 临床 血 浆 蛋 白质 组 学 主 要 是 采 用 比 较 蛋 白 质 组 学 进 行 研 究 ，通 过 比拟 患 者 和 健 康 人 、疾 病 的 不 同 时 期 、疾 病 的 不 同类 型 的 血 浆 蛋 白 质 组 的 表 达 ，在 血 浆 或 血 清 中 筛 选 疾病 相 关 性 的 蛋 白 、抗

3、 原 、抗 体 或 标 志 物 ，对 于 疾 病 的 血浆 蛋 白质 组 不 仅 含 由 肝 脏 、小 肠 等 合 成 的 蛋 白 如 白 蛋 白 ，而 且 包 含 的 免 疫 球 蛋 白 的 种类 可 达 上 千 万 种 。 另 外 ， 疾 病 或 生 理过 程 中 组 织 释 放 入 血 的 泄 漏 蛋 白 可 达 万 多种 ， 以 内分 泌 腺 体 等 分 泌 释 放 入 血 通 过 血 循 环 进 行 功 能 调 节 的各 种 肽 类 激 素 ，还 有 细 菌 感 染 或 寄 生 虫 等 释 放 入 血 的 外 源性 蛋 白 等 ， 因此 蛋 白种 类 极 其 丰 富 。 血 浆 蛋

4、白是 复 杂 多 样 的 蛋 白质 组 一诊 断 、治 疗 的 检 测 、预 后 等 具 有 指 导 意 义 ，为 疾 病 的 病 因 学 和病 理 生理 、治 疗 等 提 供 线 索 。 目前 血 浆 蛋 白 质 组 学在疾 病 研 究 中应 用 的 越 来 越 多 ，如 肺 癌。 胃癌 、前 列 腺 、种 蛋 白 即 可包 含 有 蛋 白 前 体 、剪 切 体 、糖 基 化 、 水解后 肽段 等 多 种形 式 。 同 时 还 存 在 蛋 白 一蛋 白 复 合 物 、蛋 白 一糖 类 、蛋 白 与 脂 类 等 复 合 物 。 因 此 在 电泳 图 谱 上 、 同一癌 、乳 癌 、肝 癌 ，卵

5、 巢癌 等 患 者 血 清 中均 发 现 有 特种 蛋 白 可 表 现 为 多 个 点 ，代 表 蛋 白 的各 种修 饰 体 、亚 基 、 异 的 肿瘤 标 志 物 。 在 心 梗 、心 功 能 衰 竭 患 者 中 也 寻 找 到 特肽段 。 同样 多 个 蛋 白 点 鉴 定 出 来 可 能 是 同 一 蛋 白。 因此 增异 的 生物 标 志 。 目前虽 然 已 有 基 于 质 谱 分 析 的 血 浆 蛋 白 质 组学 的各 种 技 术 ，但 是仍 处 于 初 级 阶 段 。双 向 凝 胶 电泳 作 为 唯 一 能 同 时 平 行 进 行 大 量 蛋 白复 合 物 的 定 量 表 达 检加 了

6、研 究 的 复 杂性 和 难 度 ，但 也 提 供 了 研 究 蛋 白 复 合 物 和 蛋 白 质结 构 与 功 能 变 化 的 线 索 。蛋 白 质 组 学 技 术 对 于 发 现 复 杂 生 物 基 质 中特 异 性 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 和 转 录 后 的调 节 是 一 种 敏 感 性 较 高 的 有 效 方 法 。例 如 对 血 浆 胰 蛋 白 一 抗 酶 同 工 酶 在 正 常 人 和 三 种 不 同 的 胰 蛋 白酶 缺 陷 和 先 一 抗测 的 技 术 ，仍 是 目前 最 为 广 泛 研 究 和 应 用 的 主 要 技 术 。 目 前 的 固相 梯 度 蛋 白 电泳 技

7、 术 改 进 了 以 前 两 性 载 体 电 解 质 双 向凝 胶 电 泳 在 可 重 复 性 、操 作 性 、分 辨 率 等 方 面 的 缺天 性 糖 基 化 异 常 的 多 肽 序 列 和 糖 基 化 的 特 性 鉴 定 。 此 外血 浆 中 含 有 各 种 盐 类 、电 解 质 、糖 类 、脂 类 、核 苷 酸 、 以 及 代 谢 产 物 等 ，这 些 均 不 利 于 双 向 电 泳 的 分 离 。含 盐 过 多 导 致 蛋 白质 条 纹 拖 尾 现 象 。 血 浆 蛋 白质 组 含 量 差 异 大 点 。 多 重 窄 范 围 胶 条 可 提 高 分 辨 率 ，结 合 样 品 的 预 分

8、 离 技 术 ，可 以 分 辨 以 上 个 蛋 白 常 规 可 达 蛋 白 以 及 小 于 的 蛋 白点 。 双 向 凝 胶 电 泳 不 像 液 相 色谱 质谱 鉴 定 那 样 无 法 鉴 定 等 电 点 、分 子 量 或 需 要 稳 定 同 位 素 标 记 进 行 定 量 。 双 向 凝 胶 电 泳 的 另 一 大 优 点 是 能同 时 很 容 易 显 示 多 种 蛋 白转 录 后 调 节 的 变 化 酸 化 、糖 磷 基 化 、蛋 白 溶 解 。血 浆 蛋 白质 组 含 量 差 异 大 ，也 就 是 血 浆 动 态 范 围很 大 。 高 丰 度 蛋 白浓 度 达 ，低 丰 度 蛋 白如 一

9、 些 细 胞 因 子 级等 可 在 ，甚 至 白 蛋 白 、免 疫 球 蛋 白 、转 铁 蛋 。 白 、纤 维 蛋 白原 、 巨 球 蛋 白 、抗 胰 蛋 白酶 、补 体 一 一 固相 梯 度 的 双 向凝 胶 电 泳 和 质 谱 鉴 定 技 术 目前 仍是 蛋 白 质 组 学 的 主 要 手 段 。 本 文 对 基 于 双 向 凝 胶 电 泳 技 术片 段 、结 合 珠 蛋 白等 ，其 含 量 占 血 浆 蛋 白 质 组 的 。 更 具 有 临 床 应 用 价 值 的 低 丰 度 蛋 白仅 约 。 高 丰 度 蛋 白 对 低 丰 度 蛋 白影 响较 大 ，在 双 向 凝 胶 电泳 图 谱 中

10、 可 以 干 扰 低 丰度 蛋 白 的表 达 和 鉴 别 。 因此 如 何 尽 量 避 免 或 减 少 高 丰 度 蛋 白 的影 响 ，提 高 低 丰 度 蛋 白 的 分 辨 率 是 目前 临 床 血 浆 蛋的 血 浆 蛋 白 质 组 学 研 究 的 难 点 和 最 新 的 研 究 方 法 进 行 阐述 。 基 金 项 目 ： 国 家 自然 科 学 基 金 资 助 作 者 单 位 ： 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 安 贞 医 院 血 管 外 科 京 北 白质 组 学 的一 个 主 要 技 术 难 点 。 血 浆 双 向 凝 胶 电 泳 在 样 品 制 备 和 分 离 方面 常 用 方

11、 法 去 盐 、去 脂 作 者 简 介 ： 罗 小云 一 ，男 ，主 要 从 事 血 管 外 科 临 床 和 基 础研 究。 维普资讯 :/ cqvip 第 期双 向 凝 胶 电 泳 在 临 床 血 浆 蛋 白质 组 学 研 究 中 的技 术 难 点 和 解 决 方 法 去盐 、去 脂 ，增 加 蛋 白 的 溶 解 性 。 样 品 的 制 备 主 要 包 括 减 少 杂 质 影 响 、减 少 蛋 白 酶 的 消 化 作 用 、增 加 蛋 白 的 溶 解 性 。血 浆 经 过 简 单 的 裂 解 液 稀 释 后 ， 即 可 上 样 电泳 。 但 电泳 前 去 盐 、去 脂 ，血 浆 蛋 白 的

12、完 全 溶 解 和 解 聚 有 助 于 获 得 良好 电 泳 图 谱 。 目前 传 统 的 方 法 是 在 血 浆 样 品 中 加 入 的 十二 烷 基 硫 酸 钠 和 二 硫 苏 糖醇 蛋 白的 同 时 ，也 有 可 能 非 特 异 性 的 去 除 其 他 一 些 蛋 白 ，因 为 有 许 多 蛋 白在 血 液 中 是 和 白 蛋 白 结 合 转 运 的 ， 因 此 在 利用 时 必 须 考 虑 所 检 测 的 蛋 白 是 否 与 白蛋 白结 合 ，否 那么 有 可 能 无 法得 到 目标 的蛋 白点 。 预 分 离 血浆样品 的预分 离是 双 向凝 胶 电泳技 术提 高 分辨 率 ， 特

13、别 是 检 测 低 丰 度 蛋 白 的有 效 方 法 。 血 浆 电 泳 前 样 品 的 预 分 离 根据 蛋 白所 带 的 离 子 、分 子 大 小 、 以 及 亲 和 特 性 先 分成 不 同 的 组 分 ，再 进 行 双 向 电泳 ，有 助 于 蛋 白各 组 分 的 富然 后 加 热 。 再 行 双 向 凝 胶 电 泳 ，可 明 显 改 善 图 谱 ，增 加 蛋 白 的表 达 量 。 目前 采 用 该 方 法 的 二 维 凝 胶 电 泳 图谱 已 建 成 数 据 库 ， 在 网 上 可 以 进 行 查 询 。 然 可 促 进 蛋 白 质 的可 溶 性 ，但 是 一 种 强 去 污 虽 剂

14、 ，可 以使 蛋 白充 分 变 性 。 的 负 离 子 性 可 影 响 样 品 的 等 电点 ，因 此 在 等 电 聚 焦 前 用 两 性 离 子 或 非 离 子 去 污 剂 将 样 品 中 应 稀 释 量 浓 度 以下 ， 降低 副作 用 。 质 等 比拟 了 血 浆 的 三 氯 乙 酸 、丙 酮 、 氯 仿 醇 、硫 甲酸 铵 和超 滤 的 方 法 。 三 氯 乙 酸 、丙 酮 、超 滤 等 可 更 有 效 的集 ，特 别 适 于 低 丰 度 蛋 白 的分 析 。 多 维 色 谱 预 分 离 是 将 血 浆 利 用 离 子 交 换 、 分 子 筛 、染 料 配 基 、 凝 结 素 、金 属

15、 鳌 合 成 层 析 等 多 种 分 离 方 法 结 合 在 一 起 ，可 明显 提 高 蛋 白 的 检 测 能 力 。 等 报 道 采 用 多 维 液 相 色 谱 ，双 向 凝 胶 电 泳 结 合 基 质 辅 助 激 光 解 析 四 极 杆 飞 行 时 间 和 离 子 阱 液 相 色 谱 串联 质 谱 技 术 对 病 ， 型 糖 尿 病 、充 血 性 心 力 衰 竭 患 者 的 血 清 标 记 物 及 进 行 鉴 定 ，鉴 定 出 种 疾 病 血清 中 高 表 达 的 蛋 白 。其 中 在 病 和 健 收集 蛋 白 和去 盐 ，硫 酸 铵 能 有 效 的 去 处 白蛋 白 ，但 沉 淀 法丧

16、失 蛋 白较 多 ，此 法 不 常 用 。 此外 可 以 采 用 离 心 超 滤 的 方 法 对 血 浆 去 盐 去 脂 分 离 。 这 样 对于 蛋 白点 分 离 更 清 晰 ，蛋 白 点 增 加 。 样 品 加 入 裂 解 液 后 ，应 用 分 子 筛 用 离 心 过 滤 的 方 法 ，将 盐 、脂 类 等 过 滤 掉 。分 子 筛 的 截 流 分 子 量 应 尽 量 小 ，避 免 蛋 白 的 丢 失 。在样 品制 备 的 过 程 中 ，有 一 个 通 用 原 那么 就 是 尽 可 能 简 单 ， 重 复性 好 、最 低 限 度 减 少 蛋 白 的 改 变 ， 以 防 出 现 双 向 凝

17、胶 电 泳 时 出 现 人 工 蛋 白点 。 去 除 高 丰 度 蛋 白 康对 照 的 患 者 血 清 中 中 的 组 分 中 玻 璃 粘 连 蛋 白 性 糖 蛋 白 、脂 蛋 白 、 酸 、 因 子 片 段 、 富 含 组 氨 酸 的 糖 蛋 白 含 量 具 有 区 别 。 等 采 用 离 子 交 换 和 分 子 筛 层 析 、去 高 丰 度 蛋 白等 方 法 后 等 得 到 个 组分 ，进 行 双 向凝 胶 电泳 后 得 到 个 蛋 白点 ，有 个 蛋白被 质 谱 鉴 定 。 低 丰 度 蛋 白 的检 测 还 可 根 据 蛋 白质 等 电 点 的 不 同 进 行样 品 的制 备 的 另 一

18、 重 要 技 术 就 是 去 除 高 丰 度 蛋 白。 目 分 离 。等 点 电聚 焦 预 分 离 血 浆 通 过 等 点 膜 将 血 浆 离 成 不 同 的组 分 ，结 合 多种 窄胶 条 电 泳 ，可 明显 提 高等 电点 相 近 的蛋 白 的分 辨 率 ，特 别 适 合 于 消 除 白蛋 白高 丰 度 的 影 响 。 等 利用 微 量 溶 液 等 电 聚 焦 进 行 初 步 分 馏 ，再 行 双 向 凝 胶 电 泳 ，使 电 泳 的 上 样 量 至 少 提 高 了 倍 。血 浆 样 品 的预 分 离 是 目前 较 先 进 的 方 法 ， 缺 点 是 设 备 要 求 高 ，操 作 复杂 、

19、耗 时 。 多重 窄范 围 胶 条 多重 窄 范 围 胶 条 可 提 高 双 向 凝 胶 电 泳 中 低 丰 度 蛋 白的 分 辨 率 。 以往 尽 管 增 加 上 样 量 和提 高 总 蛋 白 的溶 解 度 能增 加 分 离 时 的低 丰 度 蛋 白 的 量 ，但 同 时 增 加 了 高 丰 度 蛋 白 的 负荷 ，且 造 成 蛋 白 的 叠 加 效 应 而 影 响 分 离 ，而 且 血 浆 蛋 白大 部 分 聚 集 在 在 和 等 电点 之 间 。 窄 胶 的 微制 备技 术 可 以进 行 样 品 的 等 点 聚 焦 更 深 一 步 的 分 离 ，使 用 窄 范 围 的 胶 条 ，蛋 白

20、的 承 载 能 力 获 得 了提 高 ， 可 增 加 上 样 量 ，并 使 图谱 的分 辨 率 得 到 明 显 的 改 善 。使 用窄 梯 度 胶 可 放 大分 辨 效 果 ， 确度 可 达 。 精 此 外 血浆 蛋 白 大 多在 ， ，因 此 采 用 非 线 性 胶 条 可 增 加 图谱 大 部 分 的分 辨 率 。 而 且 有 条 来 处 理 极 碱 胶性 蛋 白 。除 了常 规 应 用 的 、 长 胶 条 ， 目前 已 有 报 道 成 功 应 用 的 胶 条 。 前 可 采 用 染 料 、免 疫 等 多 种 层 析 方 法 去 除 高 丰 度 蛋 白 。 以前 广泛 采用 染 料 亲 和

21、 层 析 去 除 血 浆 或 血 清 中蛋 白 ， 目前 已有 免 疫 亲 和 层 析 去 除 白 蛋 白 。 利 用 蛋 白 免 疫 亲 和 层 析 柱 吸 附 去 除 免 疫 球 蛋 白 、 。 等 比拟 了几 种 去除 血 浆 高 丰 度 蛋 白 白蛋 白 免 疫 球蛋 白 、 胰 蛋 白酶 、转 铁 蛋 白 、结 合 珠 蛋 白 亲 ， 抗 ， 和 基 质 包 括 活 性 染 料 、蛋 白 和 ，认 为 多 种 多 克 隆 抗 体 是 最 佳 的 方 法 。 采 用 多 种 成 分 的 多 克 隆 抗 体 免 疫 亲 和 层 析 ， 去 除 白 蛋 白 、免 疫 球 蛋 白 、转 铁

22、蛋 白 、结 合 珠 蛋 白 、 胰 一 抗 蛋 白酶 、血 红 素结 合 蛋 白 、 甲状 腺 素 运 载 蛋 白 、 糖 蛋 一 白 、 酸性 糖蛋 白 、 一 球 蛋 白 和 纤 维 蛋 白 原 后 在 双 向 一 巨 凝 胶 电泳 图 谱 上 可 至 少 个 新 的 蛋 白点 得 到 显 示 。 目前 已 有 多种 商 业 化 试 剂 盒 用 于 血 浆 蛋 白 样 品 的 预 处理 。 公 司 的 多 重 亲 和 去 除 系 统 采 用 种 多 克 隆 抗 体 可 去 除 占血 浆 的 白蛋 白 、免 疫 球 蛋 白 、转 铁 蛋 白 、纤 维 蛋 白 原 、 一一 巨 球 蛋 白等

23、 六 种 主 要 的 高 丰 度 蛋 白 ， 增 加 样 品 的 上 样 量 ， 明 显 提 上下 丰 度蛋 白 的 检 测 率 。但 该 方 法 的 缺 陷 是 去 除 白 维普资讯 :/ cqvip 北 京 生 物 医学 工 程第 卷 目前 血浆 蛋 白 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 大 多 采 用 去 除 高 丰 度蛋 白 、多 维 色谱 预 分 离 、多 重 窄 范 围胶 条 等 几 种 方 法 的 综合应 用 。如 采 用 免 疫 亲 和 层 析 去 除 高 丰 度 蛋 白结 合 离 子 交 换 和 分 子 筛层 析 后 质 谱 可 鉴 定 出 血 清 中 小 于 浓 度 的 白介

24、 素 一，组 织 蛋 白酶 、肽 类 激 素 等 。 ， ， ： ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ： 展 望 ， ， 一 ， 虽 然 双 向凝 胶 电 泳 技 术 仍 有 很 多 局 限 性 ，在 自动 化 、 重复 性 、灵 敏 度 等 还 有 待 于 改 进 ，但 仍 在 不 断 的 改 进 和 完 善 ，比方 目前 双 向凝 胶 电 泳 的 定 量 分 析 还 可 采 用 荧 光 着 多 重染 料 着 色来 比拟 不 同 标 本 图 谱 的 蛋 白差 异 性 表 达 。 以及 利用 变 性 和 非 变 性 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 分 析 与 相 结 合 的 蛋 白等 双

25、向 凝胶 电泳 一质 谱 作 为 蛋 白 质 组 学 中 最 为 直 。 观 的 分 离 和鉴 定技 术 ，是 目前 唯 一 能 在 一 张 凝 胶 同 时 分 离 成 千上 百 个 蛋 白 的 技 术 。 随 着 蛋 白 质 组 学 技 术 的 发 展 ，双 向 凝胶 电 泳 技 术 将 在 临 床 血 浆 蛋 白质 组 学 研 究 中发 挥 重 要的作用。 ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ： ， ， ： ， ， ， ， ： 】 参 考 文 献 ， ， ， ， 一 ， ， ： ： ， ， ： ， ， ， ， ， ， ： ， ， ： ， ： ， ， ， ， ， ， ， ： ， ： ，

26、：， ， ， ， ， ， ， ： ， ， ： ， ， ， ， 【 ： ， ， ，： ， ， ， ， ， ，： ， ， ， ： ， ： ， ， ， ， ： ， ： ， ， ， ， ： ，： ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ，： ， ， ， 转 第 页 下 维普资讯 :/ cqvip 北 京 生 物 医学 工 程第 卷，由 、 当 决 定 ，称 为加 权 。在 中 ，如 不 考 虑 ， ，有 同 。 、加 权 程 度 的 图 像 和 。 、 同时 加 权 的 图像 。 一 定 时 ，如， 小 于 参 考 文 献张 泽 宝 ，等 医 学 影 像 物 理 学 北 京 ：人 民 卫 生 出 版 社 ： 船 这就是说 ， 大 的 组 织 有 强 信 号 亮 ，小 的 组 织 表 现为弱信