基于纳米材料和环糊精的新型DNA电化学生物传感器的研究

1、华东师范大学博士学位论文基于纳米材料和环糊精的新型DNA电化学生物传感器的研究 姓名:常竹申请学位级别:博士专业:分析化学指导教师:何品刚;方禹之20080501学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果.据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人已经发表或撰 写过的研究成果.对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说 明并表示谢意.作者签名:!量笪 日期:学位论文授权使用声明.嘏.蔓.本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定,学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。

2、有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版.保密的学位论文在 解密后适用本规定。学位论文作者签名:l第竹 导师签名:日期:逊:塑坼哆摘要基于纳米材料和环糊精的新型DNA电化学生物传感器的研究摘要随着基因的结构与功能的研究不断深入,特别是人类基因组计划(HGP的发 展,基因的分离及分析检测在卫生防疫、医学诊断、药物研究、环境科学及生物 工程等领域发挥着越来越重要的作用。许多新的生物技术的开发,为发展高灵敏 度、高特异性的生物分析检测方法注入了活力,其中利用DNA分子间的特异性 互补配对规

3、律发展起来的各种DNA生物传感技术,引起了国内外生物分析工作 者的广泛关注。电化学DNA检测方法以其灵敏度高、轻巧便宜、携带方便、耗 能少、能与现代微电子技术联用,易于实现微型化等优点,受到了研究者们的广 泛关注,俨然成为当今生物学、医学领域的前沿性课题。纳米技术的出现为纳米材料在分析化学领域的发展和应用开辟了新的思路。 纳米颗粒的比表面积大、表面反应活性高、催化效率高、吸附能力强等优异性质, 在催化、光吸收、生物医药、磁介质及新材料等方面得到了广泛的应用,为生物 医学研究提供了新的研究途径,同时也推动了化学和生物传感器的迅速发展。纳 米粒子的独特性质与生物分子杂交反应和电化学检测方法相结合,

4、使其应用范围 更加广阔(例如:纳米生物电子。纳米粒子生物分子连接可能用于DNA疾病的诊 断,并且对生物分析化学产生巨大的影响。超分子化学是基于分子间的非共价键相互作用而形成的分子聚集体化学,在 与材料科学、生命科学、信息科学、纳米科学与技术学科的交叉融合中,超分子 化学已发展成为超分子科学。并成为创造新物质、实现新功能的一种新的重要途 径,被认为是2l世纪新概念和高技术的重要源头之一。环糊精作为超分子化学 的重要主体化合物以其独特的性质而倍受关注。对它的研究也逐渐从主客体识别 形成包合物的机理转移到对其在分析化学、医药、环境保护和传感器等领域的应 用研究中。本论文的主要创新之处就是将纳米技术、

5、层层组装技术、超分子包合作用 等与电化学分析技术相结合用于核酸分子杂交或凝血酶蛋白的分析检测,研制具摘要有高灵敏度高选择性的新型电化学生物传感器,成功地应用于对特定序列DNA 片断的选择性测定和对DNA链中的碱基尤其是单个碱基突变的快速、灵敏和准 确的识别,为基因的快速分析测定提供了一种简便、快捷、廉价的检测装置。第一章绪论首先系统介绍了DNA生物传感器及其研究进展。介绍了DNA生物传感器 的原理(包括DNA探针及其分子识别原理和DNA在固体基质表面的固定化和 分类(包括电化学DNA生物传感器,压电DNA生物传感器及光学DNA生物传 感器,其中着重介绍了电化学DNA生物传感器的原理和研究进展,

6、叙述了DNA 电化学传感器在基因检测等方面的应用,对今后的发展方向和趋势进行了展望。接着介绍了纳米材料在生物传感器中的一系列应用。最后阐述了本论文的目的和 ,意义,指出论文的创新之处及主要研究内容。第二章基于纳米颗粒Si02包裹Ru(bpy2+标记的DNA电致化学发光生物传感 器研究首次以Si02包裹Ru(bpy32+标记DNA分子,制备成高效的电致化学发光探 针,实现对目标DNA的高灵敏度特异性识别。我们合成了Si02包裹RuCoPY32+核壳式纳米颗粒,以此作为新型的ECL标记物。利用一个纳米颗粒中可包裹多 个RuCopy32+分子来达到放大ECL信号的目的,为分析检测更高的灵敏度。根据

7、DNA的碱基互补配对原则、核酸适配体对蛋白质的特异性识别能力,采用 Ru(bpy32+-Si02纳米颗粒作为标记物设计ECL生物传感器,希望能将ECL方法、 纳米颗粒带来的高灵敏度与生物识别的高特异性进行有机的结合,实现对DNA 序列以及蛋白质进行高灵敏、高特异性的研究分析。第三章基于钯纳米粒子/碳纳米管增强的DNA电化学生物传感器研究首次将钯纳米颗粒与羧基化碳纳米管结合用于DNA生物传感器的研究,借 助钯的良好催化活性和碳纳米管的较大的比表面积、极强的导电性等实现超灵敏 的DNA检测。合成了直径为34衄的钯d纳米粒子,将其与末端羧基化的 多壁碳纳米管(COOH.MWCNT结合,制得灵敏度增强

8、的电化学DNA生物传感2摘要器。首先将一定量的Nation、COOHm研CNT及Pd纳米粒子的混合液涂在玻碳 电极(GCE表面,制得MWCNT/Pd修饰电极,对该电极进行了电化学特性的研 究。然后通过5端氨基修饰的寡聚核苷酸(5-NH2-DNA与碳纳米管末端的羧基 (一COOH之间形成酰胺键而将ssDNA固定在MWCNT/Pd修饰电极上。与目标 DNA杂交后;以亚甲基蓝m为电化学杂交指示剂,实现对互补序列、非互补 序列的识别和电化学测定。在亚甲基蓝的电化学反应中,由于碳纳米管具有很好 的电子传递能力同时Pd纳米粒子具有很好的催化活性,可以使电化学DNA生 物传感器的灵敏度大大提高。对目标DNA

9、的检测下限可以达到1.2x10-13M。第四章基于层层组装技术实现DNA放大检测的电化学生物传感器研究将层层组装技术用于金纳米颗粒标记的DNA生物传感器的研究中,通过电 极表面的多次电荷翻转达到富集大量的目标DNA分子的目的,以此获得放大的 DNA杂交信息。本文介绍了聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA分子与DNA经 过层层组装(1ayer-by-layer,LBL的方法,以DNA探针分子上标记的金纳米颗粒 为电化学检测手段,实现对目标DNA杂交信号的放大。运用交流阻抗技术(EIS 和紫外吸收光谱法0w埘对LBL的过程进行研究,实验结果表明多层膜能够均 匀规则地组装在聚吡咯口P奶修饰的电极表面,

10、并通过层层组装将杂交信号放大。 在优化条件条件下,组装层为6层时,其检测限达到3.20×10。14M,该方法具有 高灵敏度和特异性。通过采用干扰序列消除非特异性吸附,这种传感器表现出良 好的稳定性和重现性。第五章基于卢环糊精主客体识别作用的DNA电化学生物传感器研究首次将主客体识别作用应用于DNA生物传感器的研究中,以伊环糊精对客 体分子间甲基苯甲酸(mTA的高效识别性成功地实现了对DNA分子的检测。将 .环糊精采用电化学方法聚合在氮乙酰基苯胺修饰的玻碳电极表面,以raTA作 为客体分子标记于5端氨基修饰寡聚核苷酸片段上,通过电化学交流阻抗对. 环糊精修饰电极捕获raTA标记的DNA

11、进行了表征。其结果显示出该电极对mTA 标记的DNA探针分子具有很强的包络作用,能够通过主客体的识别将ssDNA和 dsDNA捕获到电极表面。分别采用金纳米颗粒标记探针和以亚甲基兰为杂交指摘要示剂对目标DNA检测,均能通过主客体识别的方法获得良好的检测限。研究表 明,户环糊精修饰电极具有优良的再生性,可重复多次用于DNA的杂交检测。第六章基于金纳米颗粒聚集体富集亚甲基兰的DNA与蛋白质的电化学生物传 感器的研究首次采用金纳米颗粒标记特定序列的寡聚核苷酸片段,设计了即可用于 DNA检测又能实现对特殊蛋白质放大检测的研究方法。采用特殊设计的两段寡 聚核苷酸片段,其一端均以金纳米颗粒标记,另外一端均

12、为含有一段可以与凝血 酶蛋白产生特异性结合的核酸适配体(适体片段。当与目标分子(DNA或凝血酶 蛋白产生特异性结合作用时,该探针能与目标分子形成含有多个金纳米颗粒聚 集体,将金纳米颗粒聚集体自组装在硫代三聚氢酸修饰的金电极表面,通过探针 上的鸟嘌呤富集MB分子,实现对目标物的检测。探针上识别凝血酶的寡聚核苷 酸片段含有多个鸟嘌呤碱基,它能与MB有很强的结合作用,因此富含鸟嘌呤的 探针能够富集大量的MB分子在纳米颗粒聚集体上,同时,由于金纳米颗粒聚集 体能加速MB氧化还原反应过程的电子传递,使得MB的氧化还原反应更容易进 行,因此,对目标物的检测具有非常高的灵敏度。关键词:纳米材料,p.环糊精,

13、层层组装,DNA杂交,凝血酶,电化学检测 4Study on the novel DNA electrochemical biosensors based on nanomateirals and cyclodextrinAbstractWith improvedunderstanding of structure and function of human gene,and the development of the Human Genome Project,DNA separation and analysis has taken a more and more important ro

14、le in the areas of clinical diagnosis,medicine,epidemic prevention,env'tronmental protection and bioengineering.Wride-scale genetic testing requiresthe development easy-to-use,fast,inexpensive,miniaturized devices.Many new biological technologies emerged and found their applications in this fiel

15、d.Among them,DNA biosensors are rapidly developed and have received considerable attentions.Electrochemical DNA detection is a novel and developing technique that combining biochemical,electrochemical,medical and electronic techniques with the advantages of being simple,reliable,cheap,sensitive and

16、selective for genetic detection,and has been a hot topic in the field of biochemistry and medicine.The emergence of nanotechnology is opening new horizons for the application of nanoparticles in analytical chemistry.In particular,nanoparticles are of considerable interest in the world of nanoscience

17、 owing to their unique physical and chemical properties.With these unique properties,they are widely used in the fields of catalysis, optical absorption,medicine,magnetic medium,new materials synthesis.Such properties offer excellent prospects forchemical and biological sensing.The power and scope o

18、f such nanoparticles call be greatly enhanced by coupling them with biological recognition reactionsSupramolecular chemistry has been defined as thechemistry of molecular assemblies and of the intermolecular bond”.Combing with the material science, biological science,information technology and nanom

19、eter technology,it has been the supramolecular science and has been employed as a vital method to design,and prepare new materials and obtain novel properties.Therefore,supramolecular chemistry is believed to be the base of new concept and technology in the 21st century. 5AbstractCyclodextrin(CD,as

20、the most important h0瓯have received considerable attention because of its particular characterization,and the studies on the host-guest interaction based on CD had been transferred from the processes and mechanism of inclusion complex between a pair of host and guest to the application in the fields

21、 such嬲 analysis,medicine,environment protection and sensors.The goal of the present study is to design and optimize new DNA hybridization techniques with hi曲sensitivity and selectivity.This dissertation focuses on fabricating novel electrochemical DNA biosensors based on eletrochemical analysis tech

22、nique,combining nanomaterials,layer-bylayer technology and supramolecular inclusion interaction,thus developing a sensitive,sequencespecific and quantifiable gene detection method,and establishing the bases,especially one base mutation,then for application of electrochemical DNA biosensor to clinic

23、diagnose.Chapter 1:PrefaceFirstly,we introduce the progress of DNA biosensor,including its principle(probe identification principle and immobilization method of ssDNA on solid supportand its classification(electrochemical DNA biosensor, optical DNA biosensor and piezoelectric DNA biosensor.Among the

24、se,we emphatically review the principle, progress,the application and development trends of electrochemical DNA biosensors. Second,the application of nano-materials on biosensors Was introduced.At last,we pointed out the purpose and significance ofthe dissertation.Chapter 2:The preparation of Ru(bpy

25、32+一doped nanoparticle and its application in dectrogenerated chemiluminescence detection DNA hybridization analysis A sensitive electrogenerated chemiluminescence(ECLdetection of DNA hybridization,based on tris(2,2-bipyridylruthenium(ID-doped silica nanoparticles (Ru(bpy3z+-doped SNPs勰DNA tags,is d

26、escribed.In this protocol, Ru(bpy32+-doped SNPs was used for DNA labeling with trimethoxysilyIpropy diethylenetriamineETAand glutaraldehyde as linking agents.The6Ru(bpy32+-doped SNPs labeled DNA probe was hybridized with target DNA immobilized on the surface of PPy modified Pt electrode.The hybridiz

27、ation events were evaluated by ECL measurements and only the complementary sequence could form a double-stranded DNA(dsDNAwith DNA probe and give strong ECL signals. A three-base mismatch sequence and a noncomplementary sequence had almost negligible responses.Due to the large number of Ru(bpy32+mol

28、ecules inside SNPs, the assay allows detection at levels as low as 1.0x l 0-13tool r1of the targetDNA.The intensity of ECL was linearly related to the concentration of the complementary sequence in the range of 2.0x l 0132.Ox l 0-9tool r1.Chapter 3:Electrochemical DNA biosensors based on palladium n

29、anoparticles combined with carbon nanotubesPalladium nanoparticles,in combination with multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs,were used to fabricate a sensitivityenhanced electrochemical DNA biosensor.MWCNTs and palladium nanoparticles were dispersed in Nation,which were used to modify a glassy carbon

30、 electrode(GCE.Oligonucleotides with amino groups at the5end were covalently linked onto carboxylic groups of MWCNTs on the electrode.The hybridization events were monitored by differential pulse voltammetry(DPVmeasurement using methylene bluem嬲an indicator.Due to the ability of carbon nanotubes to

31、promote electron-transfer and the hi班catalytic activities of palladium nanoparticles for electrochemical reaction of methylene blue, the sensitivity of presented electrochemical DNA biosensors Was remarkably improved.The detection limit of the method for target DNA Was 1.2x l 0一13M.Chapter 4:Multila

32、yer membranes via layer-by-Layer deposition of PDDA and DNA with Au nanoparticles as tags for DNA biosensingA novel Au nanoparticles(Au-NPs-based protocol for DNA hybridization detection based on assembly of alternating DNA and poly(dimethyldiallylammonium chloride(PDDAmultilayer flh=ns by layerby-l

33、ayer(LBLelectrostatic adsorption has been studied.Electrochemical impedance spectroscopy(EISand UVvis 7absorl:arlce measurements were used to study the fill assembly.All the results indicate that the uniform multilayer cail be obtained Oll the polypyrrole(PPycoated electrode surface and the hybridiz

34、ation reaction carl be amplified by the layer-by-layer progress.The hybridizationWas detected the reducfive signal of Au-NPs by direct electrochemical method and nonspecific adsorption Was greatly eliminated by all irrelated DNA sequence to the target DNA.Under optimum conditions,a significant sensi

35、tivityenhancement had been obtained,and the detection limit Was down to 3.20 X 1014M when 6layers assembled.The DNA biosensor has good stability and reproducibility.Chapter 5:Electrochemical detection of DNA sequence with hostguest recognition on p-cyclodextrin modified electrodeThe electrochemical

36、sensing of DNA is accomplished farstly by the host-guest recognition system according to the very strong inclusion between3-Cyclodextrin (pCD and m-toluic acid(mTA. 13-CD, as the host molecular,Was electropolymorized on the poly(Nacetylanilinemodified glassy carbon electrode by potential sweeping,an

37、d raTA,as the guest,Was labled on the oligonucleotides with amino groups at the 5end.The inclusion between 13-CD modified electrode and mTA labeled DNA Was investigated by CV and EIS,which tamed out a strong incision interaction between them.Based on the hostguest recognition,introducing Au nanopati

38、cles as tagsand MB as indicator to detect DNA hybridization,respectively, has excellent detection limit and reproducibility.Chapter 6:Bifunctional biosensor based on aggregation methyleneblue by crosslinked Au nanoparticles and the functionalized aptamer segmentsWe report here on the construction of

39、 a biosensor call detect thrombin or DNA molecules by two functional aptamer segments,which will form Au-NPs/analyte aggregation by adding the analytes,and the redox indicator,MB,that is used to interact specifically with the guanine bases on the aptamer segments.Hybridization for DNA or incubation

40、for thrombin not only result in the binding multi-Au-NPs 8labeled probe to the analyte for formation of an extended polymericnetwork,but alsoin aggregation abundant MB molecules Oil the aptamer segments whichcall governthe signals for theanalytes.The novel bifunctional apatmer-based biosensing capab

41、ility is coupled to the enormous amplification feature of the activation for MB through the Au-NPs conductive matrix to yield remarkably low(fmoledetection limitsKey words:nanomaterials,D-cyclodextrin,layer-by.1ayer,DNA hybridization, thrombin,electrochemical detection9第一章绪论1引言第一章绪论人们回顾过去20世纪一百年中所取得

42、的辉煌成就时,最激动人心的伟大创 举之一就是和“曼哈顿的原子弹计划"、“阿波罗人类登月计划”一起被誉为本世 纪科学史上三个里程碑的“人类基因组计划(Human Genome Project,HGP这 项人类生命科学史上最伟大工程。2000年6月26日是人类科技史上一个令人难 忘的日子,参加人类基因组计划研究者,美国、英国、法国、德国、日本和中国 科学家同时向世界宣布人类基因组工作草图已基本完成,已给制出人体97%的基 因组,基中85%的基因组序列得到了精确测定,包含了人体约30亿个碱基对的 正确排序。这一重大成就立刻受到全世界的瞩目,各国均给予了高度评价,它对 人类认识自身,提高健康

43、水平,推动生命科学、医学、生物技术、制药业、农业 等的发展具有极其重要的意义,人类基因组工作草图的完成是该计划实施的一个 里程碑,标志着人类在研究自身的过程中迈出其关键的一步。有人将此成就与伽 利略的天文发现相媲美,有人认为它的意义远远大于抗生素的发明。那么究竟什么是使人们如此重视的HGP呢?我们知道所有生物的遗传物质是DNA,它的总和就是基因组,就人类基因 组而言,指合成有功能的人体各类细胞中蛋白质及或多肽链和RNA所必须的全 部DNA顺序和结构,人体遗传物质总和就是人类基因组,由大约30亿碱基对 组成,分布在细胞核的23对染色体中。人类基因组计划是测定人类基因组的全 部DNA序列,从而解读

44、所有遗传密码,揭示生命的所有奥秘。2002年2月12日,历时10载耗资20亿美元的人类基因组计划最终完成, 并报道了99%的人类基因组序列。世纪初基本完成的这项工作堪与阿姆斯特朗 和奥尔德林乘坐阿波罗11号宇宙飞船登月相媲美。从这时起,生物学被重新划 分为前基因组和后基因组两部分,我们正生活在后基因组时代。它以揭示基因组 的功能及调控机制为目标,其核心科学问题主要包括:基因组的多样性,基因组 的表达调控与蛋白产物的功能,以及模式生物基因组研究等。它的研究将为人们 深入理解人类基因组遗传语言的逻辑构架,基因结构与功能的关系,个体发育、 生长、衰老和死亡机理,神经活动和脑功能表现机理,细胞增殖,分

45、化和凋亡机 10第一章绪论理,信息传递和作用机理,疾病发生、发展的基因及基因后(如病机理、病理过 程机理以及各种生命科学问题提供共同的科学基础。功能基因组研究成果不仅 具有巨大的科学意义,而且有着十分光明、广泛的应用前景。在医疗卫生方面, 研究成果可用于医药的发现和开发;致病基因或疾病易感基因的鉴定和克隆,可 用于全新原理的诊断、治疗和预防方法的设计;医生将能够根据患者的个人遗传 构成,进行更加个人化的药物疗法;科学家们在人体器官和组织“重造以及修 复方面将取得巨大进步;以基因组成果为基础的基因组工业,将带动一批高新技 术产业向新的领域开拓。在农业、畜牧业方面,可用新的方式对动植物疾病进行 诊

46、断和处治,改善它们的品质,提高产量,在纺织业,废物控制和环境治理整顿, 都将发挥重要作用。基因组(genome是德国遗传学家H.Wmkler在1920年将基因(gene和染色体 (chromosome两个词缩合而创造的一个新词,意思是指染色体上的全部基因。几 十年来,随着分子生物学的发展,其含义扩展为在个体水平代表一个个体所有遗 传性状的总和,在细胞水平代表一个细胞所有不同染色体(单倍体的总和,在分 子水平代表一个物种所有DNA分子的总和。DNA作为遗传信息的载体,具有储存和传递信息的功能,绝大多数生物体 的遗传信息储存在DNA分子中,DNA的复制构成了遗传分子基础。DNA分子 是由两条脱氧核

47、糖核酸链组成具有复杂三维结构的大分子化合物。构成DNA的 基本单元是脱氧核糖、核苷酸和磷酸。核苷酸的碱基有四种:腺嘌呤A(adenine、 鸟嘌呤G(guanine、胸腺嘧啶T(thymine、胞嘧啶C(cytosine。核苷酸通过3,5一 磷酸二酯键连接而形成没有支链的直线形或环状结构,DNA分子中核苷酸的排 列顺序成为DNA的一级结构。DNA的二级结构一般指DNA分子的双螺旋结构, 即Waston-Criek模型,是1953年3月由Waston和Crick提出的【1】。DNA分子 是由两条脱氧核糖核酸链组成,链的内侧是碱基,两条链以平行方向盘绕同一条 轴形成右旋的双螺旋结构,两条链上的碱基

48、是匹配的(Hp G与C,A与T互补配 对,称为碱基互补(Figure 1。腺嘌呤和胸腺嘧啶以两个氢键连接,鸟嘌呤和胞 嘧啶以三个氢键连接,在DNA分子中互补碱基的含量相等。在二级结构的基础 上,DNA分子还可以扭曲或卷曲形成超螺旋三级结构。随着基因结构与基因功能研究的不断深入,特别是“人类基因组项目”的快速进展(至今,剥人类基因组30亿碱基对的“人类基因组”草图已绘制完成. 已迅速推动人类疾病的DNA诊断及基因治疗的研究,大大加快了医学基因鉴定。 发现及鉴定了大量致病基园,由于基因DNA分子序列中微小改变.导致基因突 变及多志性.如一个或几个核苷酸的取代、缺失或插入DNA序列.就会导致遗 传性

49、状的改变或各种疾病的出现。因此,通过对人体的血液、组织、体液等样品 uJ特定DNA序列的测定,可用来确定感染疾病的根源。通过检测与疾病有关的 基崮变异,将对基因筛选、药物的研制与开发、食品及环境污染的控制和在分子 水平上对遗传疾病进行诊断和治疗产生十分深远的意义。DNA片段巾核苷酸碱基的特定序列决定了基因的遗传特性,因此。DNA序 列分析是揭开遗传密码的关键,是遗传工程中首先要解决的问题之一2.31。人 类许多遗传疾病的早期诊断是通过检测已知碱基序列的DNA是否出现变异来实 现的,这些疾病中,DNA变异的复杂程度各不相同41。例如,p一珠蛋白基因的 点突变中,一个胸腺嘧啶被腺嘌呤替代,从而引起

50、氨基酸替代.导致镰刀状红血 球贫血症f51。70%的囊性纤维变性病人和携带者与转移膜控制蛋白质基因编码中 的一种三碱基残缺有关6】。亨廷顿症是因为正常的基因插入了重复的多碱基单 元而引起的7】。因此.对人体的血液、组织及体拔等样品中所含的特定DNA序第一章绪论列的测定结果,可用于确证感染疾病的细菌和病毒根源。检测与疾病有关的变异 对基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗具有十分深远的意义。DNA测序一般采用直接测序和杂交检测两种方法。杂交法因其简单、易行 而被广泛采用。用一段已知序列的单链DNA(ssDNA探针(一般为2040个碱基 的天然核苷酸片段或人工合成的寡聚核苷酸片段与未知序列的ssDNA

51、(目标 DNA进行杂交,只有与探针序列完全互补的ssDNA才能与其杂交形成稳定的双 链DNA(dsDNA结构。通过一定的方法来指示双链结构的形成,就可以推断目 标DNA的序列特征。在核酸分子杂交分析中,传统的对DNA序列的测定一般采用凝胶电泳法。 该方法需要经过放射性标记、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR、 电泳等一系列操作过程,消耗时间长,劳动强度大。在这种情况下,以Watson Crick碱基互补配对原则(即A与T,G与C形成碱基对为基础的DNA生物传感 器应运而生,为分子生物学研究提供了全新的基因检测技术,并很快成为一个研 究热点。目前大多数DN

52、A生物传感器都是建立在DNA分子杂交基础上的。一 些非放射性的新的标记方法如荧光法【8.10】、化学发光法【11.13】、电化学法 14.20等取代了传统的放射性同位素标记法,这些检测方法与DNA分子杂交 技术相结合,组成各种类型的DNA生物传感器。DNA生物传感器既免去了放射 性标记的危险性,又节省了电泳操作花费的长时间,具有操作简便、快速灵敏、 选择性好、无污染等特点,并具有分子识别、分离纯化基因等功能。因此;近年 来受到了国内外科技工作者的广泛重视,已成为基因研究中最具有吸引力的前沿 课题之-2126。目前,许多研究组正在致力于研制高灵敏度、便携式、快速的DNA检测器, 以适应生命科学研

53、究和临床诊断领域的需要。美国加州理工学院的F.Kayyem对 当前DNA检测器在诊断领域的现状作了分析,认为:目前的工业技术能够制造 高准确度的DNA检测器,快速的DNA检测器,简便的DNA检测器和价廉的 DNA检测器,但是,却未能研制集这些优点于一身的快速、准确、简便、价廉 的DNA检测器。许多专家认为:最有希望实现这一目标的是DNA生物传感器。 DNA生物传感器是分子生物学与微电子学、电化学、光学等相结合的产物,它 在生命科学与信息科学之间架起了一道桥梁,成为DNA信息分析检测最重要的绪论部分将系统介绍DNA生物传感器的基本原理及其分类,简单介绍DNA 压电和DNA光学生物传感器的工作原理

54、和特点,着重介绍DNA电化学生物传 感器的研究进展。叙述DNA的各种电化学分析方法,以及DNA.电化学传感器 的设计(包括DNA片段的固定方法以及杂交信号的电化学转化、在基因检测方 面的应用、优缺点和今后的发展趋势。随后介绍纳米材料在DNA生物传感器中 的应用。由于DNA生物传感器和基因芯片的使用还处在一个早期阶段,这种方 式(装置预计将对今后的DNA(基因诊断产生巨大的影响。2DNA生物传感器的基本原理及分类DNA生物传感器是一种能将目的DNA的存在转变为可检测的电、光、声等 信号的传感装置。DNA生物传感器和其它的生物传感器一样,其基本组成包含 有两部分28.30】,即分子识别元件(DNA

55、和换能器。识别器件主要用来感知样 品中是否含有(或含有多少待测物质,转换器件则将识别器件感知的信号转化为 可以观察记录的信号(如电流大小、频率变化、荧光强度和吸收光强度等。在待 测物、识别器件以及转化器件之间由一些生物、化学、生化作用或物理作用过程 彼此联系。其设计原理是在敏感元件上固定一条含有十几到上千个核苷酸的单链 DNA(ssDNA,在一定的条件下(包括适当的温度,一定的pH值和离子强度等, 通过DNA分子杂交,对另一条含有互补碱基序列的DNA进行识别,结合成双 链DNA(dsDNA。杂交反应在敏感元件上直接完成,换能器能将杂交后所产生 的变化转变成电信号。根据杂交前后电信号的变化量,推

56、断出被检测的DNA量。142.1DNA探针分子识别原理一段长度为17个碱基的寡聚核苷酸(DNA探针,芭人类全基因30亿碱基对中 只存在一个与之完全互补的序列,这样的特异性可以说是最高的生物选择性。各 种生物的核酸,序列相同的几率很小,所以用DNA分子杂交的技术作为DNA 生物传感器的识别原理,在理论上讲是有很大发展前景的。DNA生物传感器中 的识别分子大部分是采用化学合成而得到的单链DNA(ssDNA探针,其通过直接 吸附或5端经过巯基、氨基或生物素等偶联基团与传感器探头表面进行特定的结 合。杂交时,固定的探针与其互补序列(目标DNA之间通过Waston-Cfick氢键形 成双螺旋结构,由于这

57、种双螺旋结构的形成具有很强的选择性,因此DNA探针 能在含有多种非互补序列的混合物中识别出靶序列,从而实现传感器的特异性识 别功能。生物传感器中的生物元素不仅要具有特异性地识别生物分子的功能,同时还 必须能产生可供换能器灵敏地检测到的物理、化学变化的信号。DNA探针与目 标DNA杂交后,形成双链DNA(dsDNA,其信号可通过压电晶体的频率或SPR 折射率的改变而直接检测。但在大多数情况下,形成双链DNA本身表现的物理 信号(如光、电等信号的改变是比较弱的,因此还必须在DNA分子中加入一定 的杂交指示剂进行信号转换与放大,把杂交后的DNA含量通过换能器表达出来。 杂交指示剂是一类能与单链DNA

58、和双链DNA以不同方式相互结合的物 质。杂交指示剂与DNA分子的结合部位有三种模式:I.杂交指示剂与DNA分 子双螺旋的碱基对之间的大沟槽相互作用而结合,产生嵌入作用;2.杂交指示 剂与DNA分子双螺旋的碱基对之间的小沟槽相互作用而结合,产生粘合作用; 3.杂交指示剂与DNA分子的带负电荷的磷酸骨架之间的静电作用。选用不同的 指示剂,引起杂交后DNA分子的响应信号变化是不一样的,主要表现为电响应 和光响应的差异。2.2DNA生物传感器的分类根据换能器转换信号方式的不同,可将DNA生物传感器分为三大类:质量敏感性DNA生物传感器(压电DNA传感器、光学DNA生物传感器和电化学 DNA生物传感器。压电DNA传感技术是把电子学、声学及分子生物学等学科结合在一起的新 型的基因检测技术。其理论基础是石英谐振器表面质量的变化与频率的变化成负 相关关系。如果设法在石英谐振器上固定一条单链DNA,通过DNA分子杂交, 对另一条含有互补碱基序列的DNA进行识别,结合成双链DNA,便能构建成压 电式DNA传感器。该技术方法不需要任何标记,且仪器简单、操作方便。 此类传感器包括体波式(基于压电效应的石英晶体微天平(QCM31321和表 面声波(SAWDNA传感器33.34】。表面声波直接测定法是将单链DNA直接或间 接地固定在换能器的表面,这些换能器对杂交后双链D