第二章生物目标产物分离策略

1、第一节 生物目标产物分离过程的技术基础第二节 分离的化学过程第三节 分离的物理过程第四节 目标产物分离过程第一节 生物目标产物分离过程的技术基础 一、生物TP主要生物资源 动物、植物和微生物的组织、器官、细胞与代谢产物 动物、植物细胞的培养物、微生物发酵液及酶反应物（一）动物材料（一）动物材料 选择动物材料时要注意其生理状态（例如采用胸腺时必须是小牛）。 动物材料种类： 脏器 血液和分泌物1.脏器组织器官的来源 猪（主要），牛、羊、家禽和鱼类，等组织器官种类 胰脏、脑、胃粘膜、肝脏、脾脏、小肠、脑垂体、心脏；肺、肾、胸腺、扁桃体、甲状腺、睾丸、胎盘、羊精囊、气管软骨、眼球、鸡冠等2.血液和分泌

2、物 血液、尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒、蟾毒分泌液等。（二）植物材料（二）植物材料 植物的种属不同，产生的TP的种类也不同； 人参-皂苷、多糖 五味子-五味子素 甘草-甘草酸在同一植物中不同器官的TP也有异 人参不同部位的皂苷种类和含量不同不同季节采收的有效部位不同（三）水生生物（三）水生生物1.海洋生物 主要种类 海藻、腔肠动物、节肢动物、软体动物、棘皮动物、鱼类、爬行动物、海洋哺乳动物。 2.淡水生物 主要种类：鱼类、两栖类（蟾蜍类）。（四）微生物（四）微生物 该类生物资源特别丰富，绝大多数动、植物的有效成分均可通过不同微生物进行合成。 已研究的微生物菌株种类仅占自然界菌株总数的10；而所研究的

3、1000余种微生物代谢产物，能大量被应用于生产的仅近百种；现已知的微生物酶有数千种，但已分离并应用的仅几十种。可见，微生物资源的开发大有潜力。（五）生物技术开发生物（五）生物技术开发生物TP新资源新资源1.动植物的细胞培养及深度发酵 该项技术包含植物组织和细胞、动物细胞培养，并以类似于微生物发酵的方式，获得生物TP，即利用动植物细胞大规模培养获得生物TP。这是细胞工程技术的一大应用领域。用植物细胞培养技术生产生物碱、甾类、糖苷、香料、紫杉醇、青蒿素、香味剂、色素、杀虫剂；用动物细胞培养生产生物活性分子，如激素、单克隆抗体、酶制剂、纤溶酶原活剂、干扰素与各种疫苗。2.基因重组 根据人们的意愿对不

4、同生物的遗传基因进行切割、拼接或重组，并通过该项技术建立“工程菌”或“工程细菌”，使所需要的基因能在宿主细胞内表达，制造各种生物活性物质。适用范围：含量低、活性高的一些微量物质的生产。二、生物活性物质的存在方式二、生物活性物质的存在方式（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能 生物活性物质的存在方式与其生物功能关系密切，通常可以根据生物活性物质的生物功能推断其TP是存在于“胞内”还是“胞外”。“胞外”物质是由细胞产生，再分泌释放出来的。实质上两者没有严格界限。 （二）生物分子间的作用力 生物体系中的分子结构及分子间相互联系的作用力十分复杂。基本骨架-各原子与基团间共价结合；稳定分子间作用主要途

5、径-非共价键（氢键、盐键、金属键、范德华力、疏水力、碱基堆积力）键能较弱，性质差别较大 因此要采取不同方法解离、溶解，而且要求以不损伤其分子结构为原则。（三）生物TP分子的自组装 自组装即组成分子的单体或亚基自发地形成超分子结构（如核糖核蛋白体、病毒、膜或多酶系统）的装配过程。 生物分子的这种形成和演化不依赖外力作用，而是生物体内部相互作用的结果。 组装成生物大分子不是在能量、酶或一些模板指导下进行的，而是一个靠分子之间相互作用而自发聚集的过程。1.分子的共价结构 除脂类外，其他三类生物大分子均是由其单体重复排列成线性（或链状）结构的化合物。 连接方式：相邻的两个单体脱去一个水分子而形成共价键

6、在生物大分子的共价联结体中，尤以蛋白质与其他三类生物大分子共价连接的结构最为普遍，生物学意义也最大。原因：生物体各种生理功能均由蛋白质分子与其他生物分子共价结合所致，而不全在于各类分子本身如何组合。 2.生物分子的自组装定义：生物分子的自组装是指线状多肽链和核酸链伸长的线性结构，依照一定方式折叠或盘绕成有序的形态结构，并通过次级键维持该结构的稳定，或进一步折叠并盘绕形成超二级和三级结构，从而表达出自身的功能，这属分子内组合。有时这种分子作为亚单位或亚分子，和其他类生物分子通过次级键形成更高级结构即四级结构（如血红蛋白、多酶复合物、核酸与蛋白形成的复合物等）三、生物体内三、生物体内TP的特性的特

7、性（一）生物材料组成的复杂性生物材料中的化学组成十分复杂。不同生物含有不同种类的活性物质。同种生物，在细胞与细胞、组织与组织之间，由于细胞的类型、年龄、分化程度的不同，都会改变活性物质的组成。色素类物质和某些生理活性成分的种类与组成在不同生物间的差别更大。（二）生物活性物质的特点 生物活性物质在生物体材料中含量较低，杂质含量高，而且生理活性越高的成分，含量往往越低。如：胰岛素-万分之二； 脱氧核糖核酸酶-十万分之四； 胆红素-万分之五至万分之八； 几吨竹笋仅含数毫克竹笋素。 所以，直接从生物材料中获取含量极低的生理活性物质没有太大的工业价值，而这正是现代生物技术的重点开发领域。第二节第二节 分

8、离的化学过程分离的化学过程“生物化学TP分离过程”内容物质解离、分离后状态转移前者的操作中，需根据TP分子极性、可溶性和结合状态加一定的化学试剂，不仅要使活性物质分子处于钝化状态，不发生生物学反应，而且使TP与结合位点发生分离，然后进入溶液，或由一相进入另一相中，实现同类物质的分离和浓缩，以至最后被分离出来。一、对物质分离试剂的要求满足条件： 与TP不发生不可逆结合或化学反应，不改变其物质属性； 所采用的化学试剂易使TP发生存在状态的变化，如溶解度和分配系数的增大或减少，积聚性的增强或减弱等； 所采用的试剂不能使TP之间发生相互作用，应保持分子的原初独立状态； 所采用的化学试剂不易残存于TP中

9、而影响TP的纯度； 所采用的试剂易被回收处理，以有利降低材料的消耗； 所采用的试剂对人体和环境不造成危害。 二、对检测物质成分所用试剂的要求鉴定物质成分的试剂注意的问题： 选择与TP成分发生化学反应敏感的试剂，用量越少越好； 与TP结合的专一性及牢固强度越大越好，这样受其他物质成分和颜色的干扰较少，准确度较高。 三、对配制提取液所需试剂的要求 通过定性实验了解是什么物质，明确TP是水溶性还是脂溶性，或者兼而有之，然后再确定用什么试剂破坏分子间的结合力，从而使其溶解； 根据TP成分的用途确定试剂类型（如用于食品类物质的提取或用途，试剂要以不含有毒有害成分为准则；对只用于分析成分，只要专一性好、灵

10、敏度高即可） 根据所拥有的条件及对TP鉴定提取方法的需要进行选择。四、对提取TP溶剂pH的要求 不同物质的解离分离对pH的要求不同， 酸性物质需要在碱性条件下才能从复合物中解离出来； 碱性物质则需要在酸性条件下才能从复合中解离出来。四、对提取TP溶剂pH的要求分离提取或鉴定TP的溶液pH的要求： 有利于TP的解离、沉淀物的形成和稳定； 有利于TP沉淀或共聚物的解离，提高回收率； 在解离和沉淀的过程中，TP只有物理性状的变化而无化学结构和特性的转变； 所分离物质的可溶性好，鉴定的成分在形成有色物质时为专一性物质的反应。五、化学过程中对试剂的选择 实验方案设计中试剂的选择要求： 满足对TP最大限度

11、的溶解和分离要求，对用于鉴定物质成分的试剂要越纯越好，灵敏度和专一性越高越好； 对于作用相同或相近的试剂，成本越低越好，用量越少越好； 要使TP的溶解度越大越好并使TP与非TP易分离； 所选择的试剂只能促进TP向实验目标方向转移，尽量不产生副反应。 这些原则均需要通过了解实验内容才能真正掌握。 六、化学过程所采用的水对于水在物质分离中的使用，要按目的要求和操作方法选用水的级别和种类，洗涤器具：先选用自然水洗涤，然后用蒸馏水或去离子水冲洗；配制一般试剂：尽量用去离子水或蒸馏水；精密仪器的洗涤：初洗尽量用自然水、蒸馏水，最后用高等级的水；特殊要求的试剂的配置或实验：选择高等级的水，尽员减少分离中的

12、成本支出。第三节第三节 生物化学目标产物分离的物理过程生物化学目标产物分离的物理过程 生物化学TP分离的物理过程的实质： 将生物体中的物质成分从原材料经过分离、纯化提取出来直至成品，或对已获得的物质成分通过溶解达到能验明属于哪类物质及其含量的过程。 此过程中，只发生物质状态的变化，而无化学反应变化；是物质量的分配，而不是质的飞跃。 因此，这一过程应始终围绕解决材料中因此，这一过程应始终围绕解决材料中TP的最大解离度、的最大解离度、减少有效成分的流失和活性的降低；减少有效成分的流失和活性的降低； 对于这个过程本身，要注意对每个操作手段的选择，既要对于这个过程本身，要注意对每个操作手段的选择，既要

13、彼此联系紧密，又要注意各自的独立性和个性。彼此联系紧密，又要注意各自的独立性和个性。一、TP分离中物理过程的特点（一）生产性生化分离 (1) 物质状态变化 整个实验过程中，TP从一个状态转变为另一个状态，单位所含TP比率由低到高，而最终TP总量较原料对TP所含数量大为降低。 (2) 影响TP存在状态的因素： TP状态的转变只受物理因素（如温度、压力、黏度、溶剂的介电常数及产品中非TP的种类和含量等）的制约。 (3) 影响TP分离量的因素： 整个操作过程表现为伴随产品中所含杂质的减少，物质总活性或生物学效价在成倍的上升。 (4) 分离过程中无TP的性质改变： 只有能量的消耗和仪器设备的性能衰变。

14、一、TP分离中物理过程的特点（二）物质成分的检测分析 (1) TP感官指标： 分离的TP随分离进程的延续，其特征性的色、香、味等越来越突出。 (2) TP的固有特性愈加突出： 该过程只有量的消耗，目的成分的理化性质、含量和存在状态相对不变。 (3) TP占有率明显提高： 只有量的消耗，目的成分和属性明朗化。 (4) TP应用性增强： TP面向社会的支撑度增大，最终成为社会的财富。二、完成TP的分离的物理过程所需设备的选择 TP分离的物理过程所需工具和手段是能规模性或批量生产的设备。 因此，设备是提高分离效果的关键问题。怎样选择设备是成功实现分离的不可缺少步骤。（一）依据分离性质选择 (1) 生

15、产性实验： 要从物质分离角度出发，选择对样品进行粉碎、匀浆、过滤、收集、除垢、干燥及制品分析等的设施。 (2) 有效物质成分类的分析鉴定： 考虑样品的称量、溶解、过滤并便于检测或定量测试，选择称重器具、常规容器、量具及分光度比色测定的器具。 (3) 定性定量的兼性分离： 根据上述两个原则认真挑选。由于这类工作一般具有综合性，既有定量分析又有定性分析，量大、任务重、处理的材料多，使用的方法和技术路线较复杂，途径和环节较多，因此，尽量选取工作效率高、精确度大、分辨率好的器具。（二）对方法的设计选择 （1) 探索性分离： 首先通过充分阅览资料文献，大量收集信息； 然后对其加以分析，比较找出问题， 对

16、近1-2年SCI、EI及同类著名期刊所发表的同类研究报道中所采用的方法加以思考，结合自己的思路，选择性吸收利用，对其方法中所使用的条件要有充分的掌握，才能使自己有所创新。 (2）验证性分离： 这类分离性工作虽然资料较多，可以照搬，但是对提高工作效果，促进对生产的指导毫无益处，一定要多找出几种方法，对所测参数加以比较，找出共同点和不同点，优点和缺点，然后吸收众多方法的优点，改造其中的缺点，设计自己的方案 （三）TP分离器具和方法选择的忌讳(1) 符合现实条件： 成功分离需要有精良的仪器和方法，但勿凭主观想象，超越客观实际。必须在力所能及的范围内，否则设计的分离方案只是空中楼阁，无法实现。 (2)

17、 根据所设计的分离方案选择器具： 分离方案是选择器具的依据，如生产性的实验，时时刻刻离不开物质的分离。不思而言，其离心机是关健，层析柱和浓缩干燥少不了，对于TP的分析鉴定离不开量具和分光光度计等。 (3) 所选择的仪器、方法勿贪大求全： TP的生产过程贵在思路，有些分离本身就不需要复杂的步骤。 (4) 忌分离方案设计与实践应用脱轨： 基于生化分离目的要求的精确性、敏感性、理化因素的影响，每个方法步骤的提出、设备的选择、试剂的运用，要注意温度、pH,离子强度对TP活性、存在状态的影响。第四节第四节 目标产物分离过程目标产物分离过程一、生物TP的分离过程 分离的TP主要来源于生物反应过程。生物反应

18、的产物属于细胞、游离的细胞外代谢产物、细胞内代谢产物、残存底物及惰性组分组成的混合液。 常见的生物药物、天然药物（中药）和食品添加剂的分离制备是通过细胞（包括微生物和动植物细胞）培养生产生物物质的（图9-1）。二、生物分离过程的特点（一）生物物质易失活 生物TP的活性大多在生物体内的温和条件下维持并发挥作用，当在高温，pH改变以及某些化学药物存在等环境因素急剧变化时不仅极不稳定，使活性降低甚至丧失，而且原料液中常存在降解TP的杂质（可水解蛋白质的蛋白酶）。 因此，必须设计合理的分离过程和操作条件，实现TP的快速分离纯化，获得高活性TP。 （二）生物TP与人类生活息息相关 用作医药、食品和化妆品

19、的生物产物的分离纯化过程必须将原料液中含有的热原及具有免疫原性的异体蛋白质等有害人类健康的物质清除，并且防止这些物质在分离操作过程中从外界掺入。（三）需通过具有高度选择性的分子识别技术或高效分离方法除去TP的类似物 原料液中不仅存在与目标分子在结构、成分、理化性质上极其相似的分子及异构体，形成用常规方法难以分离的混合物，而且TP原料的成分复杂。（四）所分离的TP在原材料中含量低 在恒温条件下使混合物中的各组分分离为纯物质所需的最小功Wmin与吉布斯自由能变化G相等，即 式中，i为组分数；x为摩尔分数，为活度系数；R为摩尔气体常量；T为热力学温度。minlniiiWGx RTx 在稀溶液中溶剂的

20、摩尔分数近似为1，故i1。那么得到纯组分i所需的最小功则为 从式可以看出，纯化1 mol组分i需要RTlnxi的功，即得到单位质量物质i需要的能耗与ln(1xi）成正比。因此，原料中TP浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。min,lniiiiWx RTx 图9-2为每千克生物产品售价(P)与原料液中TP量浓度（c）的双对数坐标图，P和c的关系可近似表示为 cPk(常数） P=k/c 即产品的售价与原料液的质量浓度成反比，质量浓度越高售价越低，反映了原料质量浓度对生产生程成本的显著影响。三、生物TP分离技术与原理 分离的本质：有效地识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物学性质的差别，采用能

21、识别这些差别的分离介质和扩大这些差别的分离设备，实现溶质间的分离或目标组分的纯化。因不同性质的溶质在分离操作中具有不同的传定速率平衡状态，因此可实现彼此分离（一）物理性质(1)力学性质： 溶质密度、大小和形状。根据这些力学性质的差别，可进行颗粒（如细胞）的重力沉降、分子或颗粒的离心分离和膜离（筛分）。 (2)热力学性质： 溶质的溶解度（液固相平衡）、挥发度（气液相平衡）、表面活性及相间分配平衡行为等。利用这些性质进行物质分离的方法较多，如蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶或沉淀、泡沫分离、吸附和离子交换等，可以依所处情况和条件选择。(3)传质性质： 包括黏度、分子扩散系数和热扩散现象等。利用传质速度

22、的差别也可分离TP，对这些性质的直接应用虽较少，但传质现象在分离过程中具有重要作用 (4)电磁性质： 指溶质的荷电特性、电荷分布、等电点和磁性等。电泳、电色谱、电渗析、离子交换、磁性分离等方法，即利用溶质的这类性质，设立一定的外加磁场实现对TP的分离纯化。 如根据电磁效应，对真核生物多嘌呤核苷酸尾巴结构mRNA的磁性分离等。（二）化学性质 包括化学热力学（化学平衡）、反应动力学（反应速率）和光化学特性（如激光激发作用）等。 化学吸附和化学吸收是利用化学反应进行分离的典型例证；利用激光激发的离子化作用可进行同位素分离。 （三）生物学性质 生物学性质的应用是生物大分子分离特有的，具有严格的局限性.

23、 利用生物分子（或生物分子聚集体、细胞）间的分子识别作用，可进行生物物质（例如细胞、病毒、蛋白质、核酸、寡聚核苷酸）的亲和分离，其中亲和色谱是亲和分离的典型代表。 此外，利用酶反应（包括微生物反应）的立体选择性，可对手性分子进行选择性修饰。扩大手性分子间理化性质的差别，从而为利用常规方法（例如色谱）分离手性分子奠定基础。从分离操作的角度将分离技术分类：基于相间分配平衡差异的平衡分离法；外力作用下产生的溶质移动速度差别的差速分离法。(1) 平衡分离法： 根据溶质在两相（如气液、气固、液液、液固、气固）间分配平衡的差异实现分离。 溶质达到分配平衡的推动力的大小仅取决于系统的热力学性质。即溶质偏离平衡态的