临床分子生物学检验总

1、四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA）为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1.菌种鉴定：PCR-M序和PCR-DNA探针杂交；缩短检测时间2 .确定病毒感染和病毒载量：明确感染源，判断病情，监测疗效3 .病毒分析：基因型变异产生不同临床症状4 .细菌耐药监测和分子流行病学调查：随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1.致病基

2、因的分子缺陷2.线粒体基因突3.肿瘤相关基因单基因病1.致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。2.致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2.疾病诊断和遗传咨询3.多基因病的研究4.器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染

3、的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所（EBI）3.日本国立遗传研究所（DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPROT等。蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等。蛋白质数据库常用的有SWISS-PROT、PIR、PDB数据库。二级数据库非常多，如人类基因组图谱库GDB、转录因子和结合位点库TRANSFAC、蛋白质结构家族库SCOP等。*乙型肝炎病毒核酸的检测

4、常用技术：1.普通PCR技术2.荧光定量PCR技术3.支链DNA技术4.核酸杂交技术5.杂交捕获系统6.基因芯片技术*HBV基因分型的方法：1,PCR-RFLP2.PCR-RBD3.ELISA4.基因芯片人乳头瘤病毒基因组结构：HPVDNA为一双链闭环分子，基因组可分三个区段：早期区（E）、晚期区（L）、长控制区或上游调节区或非编码区。*HPVDNA检测及基因分型：1.核酸杂交技术（主要包括核酸印迹、原位杂交、杂交捕获等技术。目前常采用HCII技术、核酸分子杂交与PCR相结合的方法。具有较强的特异性，并可分型）2.PCR技术*（采用型特异性引物进行HPV快速分型，现已成为HPV感染最常用的检测

5、方法之一。目前常用通用引物-PCR（GP-PCR）和实时定量PCR。1.GP-PCR,依据不同HPV亚型有共同保守序列的特点来设计通用引物，可广谱扩增HPVDNA，具有较高的敏感性，可检测出10-400拷贝的HPV病毒含量。在GP-PCR的基础上，建立了巢式PCR和巢式多重PCR检测HPVDNA。提高了检测敏感性和多重感染率。2.实时定量PCR法，该法可实现HPVDNA定量和快速检测。现在市售产品可以检测E6和E7的mRNA；进行HPV16、18、31、33与45分型。检测灵敏度高，但设备昂贵，操作繁琐，不适于宫颈癌的大规模筛查。）3.基因芯片技术（基因芯片可对HPV进行分型和多重感染诊断，适

6、于高通量HPV筛查）4.流式荧光液芯技术5.飞行时间质谱技术临床意义：（一）宫颈疾病风险预测（二）疗效评估及术后跟踪（三）预防控制和疫苗研发*HIV-1基因组中，gagpol、env为结构基因，编码病毒核心蛋白（gag）多聚酶（pol）、和外膜蛋白（env）。vpr、rev、vif、tat、vpu/vpx、nef等6个基因为调控基因，编码调控蛋白和辅助蛋白。核酸序列依赖扩增（NASBA）是一种等温扩增RNA的技术，能直接扩增单链RNA特异序列，通过合成cDNA，在等温条件下进行体外序列特异性核酸扩增。NASBA需要AMV逆转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7RNA聚合酶共同作用完成。NASBA分非

7、循环相（模板RNA与引物I互补）和循环相（转录的反义RNA与引物n互补两个阶段流行性感冒病毒核酸检测：主要有RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、基因芯片、逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）等。结核分枝杆菌核酸的检测:1.PCR2.Real-timePCR3.PCR-RFLP4线性探针杂交法.（LPA）5.链替代扩增技术（SDA）6.扩增结核分枝杆菌直接试验（AMTDT）7.基因芯片技术8.GeneXpert全自动结合检测平台结核分枝杆菌的耐药性检测:（1）DNA测序（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）PCR-RDB（5）基因芯片技术淋病奈瑟菌核酸的检测：1.PCR2实时

8、荧光定量PCR技术3.连接酶链反应4连替代扩增技术（SDA）淋病奈瑟菌的主要耐药基因：（1）gyrA和parC基因（2）penA、ponA基因（3）porB基因（4）Mtr系统调控基因（5）erm基因淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术:（1）DNA测序（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）基因芯片技术*医院细菌感染的常用分子生物学检验技术：1.脉冲场凝胶电泳（PFGE）被认为是菌株分子分型的“金标准”2.PCR-RFLP3.扩增限制性片段长度多态性分析（AFLP）4.重复序列PCR5.随机扩增多态性DNA技术6.多位点测序分型白假丝酵母菌的分子生物学检验：1.PCR普通PCR、实时

9、PCR、巢式PCR和多重PCR等2.PCR-S点杂交3.DNA指纹技术，包括RFLP、随即扩增多态性分析（RADP）、电泳核型分析等4.AP-PCR5.DNA序列分析6.基因芯片技术新型隐球菌的分子生物学检验：1.PCR2.斑点杂交3.PCR-RFLP沙眼衣原体的分子生物学检验：1.PCR2.连接酶链反应3.DNA序列分析肺炎衣原体的分子生物学检验：PCR、实时荧光定量PCR技术、巢式PCR和竞争性PCR肺炎支原体的分子生物学检验：1.PCR2.核酸杂交，探针有特异性DNA片段探针、人工合成的寡核苷酸探针、全DNA探针。常用斑点杂交。3.PCR-RFLP梅毒螺旋体的分子生物学检验：1.PCR2

10、.核酸杂交3.PCR-RFLP分子生物学检验可早期诊断患者的梅毒感染，及时治疗，防止病情恶化与蔓延。另外是耐药基因分析和流行病学研究的首选方法。弓形虫DNA主要有三种形式：染色体DNA、线粒体DNA、和胞质DNA利用分子生物学技术已检出弓形虫的主要基因有B1基因、P22基因（SAG2）、P30基因（SAG1）、P43（SAG3）和棒状体蛋白1（ROP1）等。分生检测：1.PCR主要侧重检测B1基因和P30基因。2.斑点杂交a珠蛋白合成障碍性贫血的分子生物学检验1.PCR2.SouthernER迹杂交3.AS-PCR4.SSCP5.gap-PCRB珠蛋白生成障碍性贫血的分子生物学检验：PCR-R

11、DB、PCR-RFLP、基因芯片、PCR-ASO、AS-PCR编辑版 word血友病B的分子生物学检验：直接检测法有Southern印迹杂交、DNA测序、基因芯片和毛细管电泳；间接检测方法有RFLP、SSCP变性梯度凝胶电泳（DGGE）、双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱（DHPLC）。脆性X综合征的分子生物学检验：（一）Southern印迹杂交（二）PCR（三）微卫星序列分析通过分子诊断FMR-1基因突变开展患者判定、携带者筛查、产前诊断和群体筛查等。肿瘤相关的基因：原癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因以及维持细胞基因组稳定性基因等。细胞周期调节基因：周期蛋白（cyclins）、

12、周期蛋白依赖性激酶（CDKs）、CDK抑制因子（CKIs）及细胞周期检查点等其他蛋白细胞凋亡相关基因可分三类：促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡基因、细胞凋亡过程中表达的基因。p53是研究的较为充分的与肿瘤发生、发展关系明确的抑癌基因，绝大多数肿瘤都伴有p53基因的突变。乳腺癌（17号染色体长臂上）的发生、发展紧密联系的基因有BRCA1、BRCA2、TP53、c-erbB2、c-Myc、P53、Bcl-2、BAX、iASPP、ATM、MDM-2以及PTEN等乳腺癌的分子生物学检验：1.雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）检测（免疫组织化学）2.c-erbB-2/HER2检测（免疫组化、荧光原位杂交

13、）3.PS2检测4.Ki67检测5.乳腺癌复发基因检测（DNA微集阵列技术、多基因RT-PCR定量检测技术）（70基因检测方法、21基因检测方法）遗传性结直肠癌相关基因：结肠腺瘤性息肉病（APC）基因、DNA错配修复（MMR）基因、微卫星异常微卫星异常主要表现为：微卫星不稳定性（MSI）;微卫星杂合性丢失（LOH）。结直肠癌的分子生物学检验：1.HNPCC的筛查2.微卫星异常检测3.APC基因突变检测4.DCC基因突变检测5.DNA甲基化的检测6.结直肠癌个体化治疗的相关检测白血病相关基因突变：C-KIT、FLT3、NPM（核仁磷酸蛋白）、N-RAS、NOTCH1白血病相关基因表达异常：WT1

14、、HOX11、白血病融合基因。（WT1可作为不伴特异分子异常的AML微小残留白血病（MRD）的理想检测指标）白血病的分子生物学检验：FISH、PCR、RT-PCR、实时定量PCR（FISH适于多种临床标本，但灵敏度不及PCR,主要用于初诊和复发的检测。）线粒体12SrRNA基因的A1555G和C1494T突变是导致氨基糖甘类抗生素耳毒性的主要分子致病基础。tRNASer（UCN）T7511c等突变则与非综合征型耳聋相关；而tRNALeu（UUR）A3243G等突变可导致综合征型耳聋。耳聋相关的mtDNA突变的检测：1.PCR-RFLP2.DHPLC3.DNA测序4基因芯片LHON（Leber遗

15、传性视神经病变）相关的mtDNA突变位点的检测方法有PCR-RFLP、PCR-SSCPDHPLC、DNA测序、荧光定量PCR、AS-PCR、及基因芯片等tRNALeu（UUR）A3243G仍是目前国际上唯一公认的线粒体糖尿病致病突变线粒体糖尿病的分子生物学方法：PCR-DHPLC、PCR-RFLP、PCR-U序、荧光定量PCR、基因芯片等。染色体结构异常类型有缺失、重复、倒位、等臂染色体、环状染色体、易位等类型。染色体疾病常用的分子生物学检验技术：FISH、MLPA、CGH、无损伤产前染色体病分子生物学检验技术药物相关基因分类：药物作用靶点相关基因、药物代谢酶基因（CYP450、N-乙酰基转移

16、酶）、药物副反应相关基因植入前遗传学诊断（PGD）:PCR及其相关技术、多色荧光原位杂交技术、全基因组扩增及基因芯片等相继应用于PGD。PGD最早适用于包括性别诊断、某些单基因遗传病、染色体结构与数目异常等植入前遗传学诊断（PGD）常用的分子生物学技术：单细胞PCR技术、荧光原位杂交、植入前遗传学单倍型分析（PGH）技术、非整倍体筛选（PGS）分子生物学技术在HLA分型中的应用（DNA分型技术）：1.RFLP与PCR-RFLP技术2.PCR-SSCPK术3.测序技术4.PCR-SSO支术5.PCR-SSPK术6基因芯片技术7.流式细胞仪技术8.氨基酸残基配型标准分型技术测序技术（是最可靠、最直

17、接、最准确的HLA分型方法）法医物证学主要内容包括：个体识别、亲子鉴定、性别鉴定、种族和种属认定。核酸标志物存在多种不同的形式，包括基因突变位点、基因多态性位点、等位基因、mRNA、mircoRNA、线粒体DNA、病原生物基因组DNA、DNA甲基化位点和循环核酸等。荧光原位杂交技术（FISH）的原理：将标记的核酸探针变性后，利用探针与被检样本上已变性的靶核酸序列在退火温度下复性，进行分子杂交，对大的靶序列（>1kb）采用直接标记的荧光探针，对于小的靶核酸序列以及弱杂交信号通过生物素或地高辛标记核酸探针，在用荧光标记的配体（如抗体）进行杂交信号放大，最后用荧光显微镜观察荧光信号，在不改变被

18、检标本（即维持其原位）的情况下对靶核酸序列进行定位、定性与半定量分析。（用于FISH的探针可以是DNA或RNA,核酸探针的标记方法可用缺口翻译法、随机引物法、PCR法或体外转录法）FISH是一种非放射性原位杂交，其原理是将标记了荧光的探针与固定在载玻片上细胞染色体或染色质的特异部位进行原位杂交，然后用荧光显微镜在不同波长的激发光下观察，判断特定染色体的数目或其存在或缺失的情况。具有简单、快速、灵敏度高、特异性强等优点。荧光原位杂交技术的方法特点：1.简便、稳定、直观、省时2.检测结果的局限性FISH检测的一般过程标本玻片的制备；标本预处理；探针和标本的变性；原位杂交；杂交后的洗涤和复染；FIS

19、H信号分析。多重连接依赖性探针扩增（MLPA）:利用多重PCR扩增反应检测与探针杂交和连接反应的组合，可在同一反应管内同时检测被检样本4050个不同的DNA或RNA序列的拷贝数变化。MLPA技术的原理：样本的每个被检测位点包括两个特异的寡核甘酸片段探针，一个由化学合成（5'端探针，如图1A和2A）,另一个通常经M13噬菌体衍生法制备（也可由化学合成法合成，探针设计略有不同）的探针（3'端探针，1B和2B）,5'端探针包括探针5'端一段通用引物序列X和一段探针的3'端与靶序列杂交的特异性序列，而3'端探针包括始于探针5'端的一段与靶序列杂交特异性序列、中间的填充序