生化分离工程复习 ppt课件

1、生化分别工程生化分别工程复习复习n 据各种资料统计，分别纯化过程所需的费用要占产品总本据各种资料统计，分别纯化过程所需的费用要占产品总本钱的很大比例，按产品不同。钱的很大比例，按产品不同。n 对抗生素消费而言，分别纯化部分的投资费用约为发酵部对抗生素消费而言，分别纯化部分的投资费用约为发酵部分的分的4倍；对有机酸或氨基酸消费而言，那么为倍；对有机酸或氨基酸消费而言，那么为1.5倍；对倍；对基因工程药物，分别纯化技术的要求更高，如重组基因工程药物，分别纯化技术的要求更高，如重组DNA蛋蛋白质精制的费用可占整个消费费用的白质精制的费用可占整个消费费用的8090%；对于血液；对于血液制品，分别纯化几

2、乎占整个消费费用的制品，分别纯化几乎占整个消费费用的100%。n 因此人们逐渐认识到下游工程的落后有能够会妨碍生物技因此人们逐渐认识到下游工程的落后有能够会妨碍生物技术的开展。术的开展。一、一、 分别纯化的普通步骤分别纯化的普通步骤n(1) 发酵液的预处置和固液分别发酵液的预处置和固液分别 ；n(2) 初步分别初步分别(提取提取) ；n(3) 高度纯化高度纯化(精制精制) ；n(4) 废品加工。废品加工。 二、多肽和蛋白质的纯化二、多肽和蛋白质的纯化n 多肽和蛋白质的纯化包括两部分内容。多肽和蛋白质的纯化包括两部分内容。n 一是将蛋白质与非蛋白质分开，二是将不同的蛋白质分开。一是将蛋白质与非蛋

3、白质分开，二是将不同的蛋白质分开。n 对非蛋白部分可以根据其性质采用适当的方法去除。而对于不同蛋白对非蛋白部分可以根据其性质采用适当的方法去除。而对于不同蛋白质的分别那么可以利用它们之间性质上的差别进展。常用的方法有质的分别那么可以利用它们之间性质上的差别进展。常用的方法有:n (一一)利用溶解度不同的纯化方法利用溶解度不同的纯化方法 有盐析法、有机溶剂法、等电点沉淀有盐析法、有机溶剂法、等电点沉淀法、加热变性法等。法、加热变性法等。n (二二)利用分子外形和大小不同的纯化方法利用分子外形和大小不同的纯化方法 凝胶层析法、透析法等。凝胶层析法、透析法等。n (三三)利用电离性质不同的纯化方法利

4、用电离性质不同的纯化方法 离子交换法、电泳法等。离子交换法、电泳法等。n (四四)利用生物功能专注性的不同纯化蛋白质利用生物功能专注性的不同纯化蛋白质 亲和层析法等。亲和层析法等。 三、蛋白质分别纯化举例三、蛋白质分别纯化举例 n 3.1 重组人粒细胞重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子n 人粒细胞人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF是一种可由是一种可由体内多种细胞产生的细胞因子，如激活的体内多种细胞产生的细胞因子，如激活的T、B淋巴细胞、

5、成淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，可作用于造血干细胞，促进其增殖、纤维细胞、内皮细胞等，可作用于造血干细胞，促进其增殖、分化，构成中性粒细胞和巨噬细胞群，同时还能刺激噬酸性分化，构成中性粒细胞和巨噬细胞群，同时还能刺激噬酸性粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的构成和增殖。粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的构成和增殖。n 1993年获美国年获美国FDA同意重组同意重组GM-CSFrhGM-CSF用于临用于临床。主要用于治疗肿瘤化疗产生的造血妨碍、再生妨碍性贫床。主要用于治疗肿瘤化疗产生的造血妨碍、再生妨碍性贫血、骨髓异常增生综合征等，还用于加强免疫、骨髓移植等。血、骨髓异常增生综合征

6、等，还用于加强免疫、骨髓移植等。 3.1.1 GM-CSF的特性的特性n 分泌到细胞外的成熟人由分泌到细胞外的成熟人由127个氨基酸残基组成，分子量个氨基酸残基组成，分子量为为22kD。n 不同来源的不同来源的GM-CSF分子量范围为分子量范围为14.5kD35kD，分子，分子量差别是由糖基化程度不同呵斥的。但糖基化程度不同的量差别是由糖基化程度不同呵斥的。但糖基化程度不同的GM-CSF生物学活性却没有明显的不同，甚至有报道大肠生物学活性却没有明显的不同，甚至有报道大肠杆菌表达的非糖基化杆菌表达的非糖基化GM-CSF比真核细胞表达的糖基化比真核细胞表达的糖基化GM-CSF具有更高的生物学活性。

7、具有更高的生物学活性。n GM-CSF的分子由两个反向平行的的分子由两个反向平行的折叠和四个反向平折叠和四个反向平行的行的螺旋组成，有两个二硫键分别衔接螺旋螺旋组成，有两个二硫键分别衔接螺旋B和和折叠折叠的第二条链、螺旋的第二条链、螺旋C和羧基末端。和羧基末端。n rhGM-CSF的的pI为为5.4。 3.1.2 GM-CSF的分别和纯化的分别和纯化n 本例是以包涵体的方式进展表达的。本例是以包涵体的方式进展表达的。n I)搜集菌体细胞搜集菌体细胞 n 发酵后的工程菌以发酵后的工程菌以7000r/min离心离心30min，用，用50mmol/L Tris-盐酸缓冲液反复洗涤、离心盐酸缓冲液反复

8、洗涤、离心3次，去上清液。次，去上清液。n II)细胞破碎与包涵体的搜集细胞破碎与包涵体的搜集n 沉淀菌体细胞加沉淀菌体细胞加4倍体积倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(含含5mmol/L EDTA)，冷浴搅匀，置超声破碎器中破菌，每次，冷浴搅匀，置超声破碎器中破菌，每次30s，间隔，间隔30s，反复破碎直至革兰染色镜检无完好的菌体止。，反复破碎直至革兰染色镜检无完好的菌体止。5000g离心离心30min，去上清，沉淀即含有包涵体。，去上清，沉淀即含有包涵体。3.1.2 GM-CSF的分别和纯化的分别和纯化n III)包涵体的洗涤包涵体的洗涤n 上述沉淀参与上述沉淀参与9倍体积倍体

9、积20mmol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(含含0.5%TritonX I00)，5000g离心离心30min，沉淀参与，沉淀参与9倍体倍体积积20mmol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(含含0.5mol/L脲脲)，同法离心，沉，同法离心，沉淀参与淀参与6倍体积倍体积20mmol磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(含含5mmol/L EDTA)，以以10000g离心离心30min，搜集沉淀。，搜集沉淀。n IV)包涵体的变性与复性包涵体的变性与复性n 上步沉淀参与上步沉淀参与8mol/L脲溶液，振摇脲溶液，振摇l2h，40000g离心离心30min。用逐渐稀释法将上清液脲浓度稀释至。用逐渐稀释法将上清液脲

10、浓度稀释至0.lmol/L，复性复性24h，以，以17000g离心离心30min，上清液即为复性的，上清液即为复性的rhGM-CSF粗产品。粗产品。3.1.2 GM-CSF的分别和纯化的分别和纯化n V)色谱法纯化色谱法纯化 n V-I疏水色谱疏水色谱 n 将将Phenyl-Sepharose 6 FF色谱柱用色谱柱用50mmol/L磷酸磷酸-7%NH4)2SO4液液(pH6.9)平衡。平衡。n 复性粗产品参与复性粗产品参与NH4)2SO4 使其浓度达使其浓度达7%(w/v)，上样。，上样。n 用用50mmol/L磷酸磷酸-7%NH4)2SO4液液(pH6.9)、20mmol磷磷酸盐缓冲液酸盐

11、缓冲液pH7.0及及30%异丙醇依次洗脱，异丙醇依次洗脱，280nm紫紫外检测，搜集洗脱峰，电泳银染色检定。外检测，搜集洗脱峰，电泳银染色检定。3.1.2 GM-CSF的分别和纯化的分别和纯化n V-II离子交换色谱离子交换色谱 n 装装DEAE-Sepharose FF色谱柱，以色谱柱，以20mmol/L磷酸磷酸盐缓冲液盐缓冲液(pH6.5)平衡至基线。平衡至基线。n 加上步得到的目的产物，以加上步得到的目的产物，以20mmol/L磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液液(pH6.5)、20mmol/L磷酸盐磷酸盐-0.l5mol/L NaCl液液(pH6.5)、20mmol/L磷酸盐磷酸盐-lmol/L

12、NaCl液液(pH6.4)分别洗脱，搜集洗脱峰，电泳检定。分别洗脱，搜集洗脱峰，电泳检定。3.1.2 GM-CSF的分别和纯化的分别和纯化n V-III凝胶色谱凝胶色谱 n 装装Sephacryl S 200色谱柱，以色谱柱，以20mmol/L磷酸盐磷酸盐-0.l5mol/L NaCl液液(pH6.5)平衡，上步目的产物上平衡，上步目的产物上样后以一样的缓冲液进展洗脱，搜集吸收峰，产样后以一样的缓冲液进展洗脱，搜集吸收峰，产品经品经0.2m滤膜过滤。滤膜过滤。n 本法所得本法所得rhGM-CSF产品，经产品，经HPLC检测为单一检测为单一峰，纯度为峰，纯度为99%；SDS-PAGE显示为一条带

13、，分显示为一条带，分子量为子量为14kD；生物活性为；生物活性为1.591071.86107u/mg3.2 人神经细胞生长因子人神经细胞生长因子n神经生长因子神经生长因子nerve growth factor, NGF是神经系统最重要的生物活性分子之一，是神经系统最重要的生物活性分子之一，也是最早发现和最典型的神运营养因子，也是最早发现和最典型的神运营养因子，它们影响外周神经及中枢神经系统某些神它们影响外周神经及中枢神经系统某些神经元的存活与分化，可促进损伤神经系统经元的存活与分化，可促进损伤神经系统的再生与修复。的再生与修复。nNGF还具有免疫调理作用。还具有免疫调理作用。 3.2.1 NG

14、F的特性的特性 n人人NGFhNGF的前肽原含的前肽原含241个氨基酸个氨基酸残基，信号肽为残基，信号肽为18个氨基酸残基。个氨基酸残基。n 成熟成熟hNGF为为l20个氨基酸残基，分子量为个氨基酸残基，分子量为1.3kD，有，有1个个N-糖基化位点，糖基化位点，6个个Cys残基，残基，构成构成3个链内二硫键，个链内二硫键，pI为为8.86。n 在体内以二聚体存在。在体内以二聚体存在。 3.2.2 分别纯化分别纯化n本例是以人胎盘为原料提取本例是以人胎盘为原料提取hNGF。n I). 胎盘绒毛的分别胎盘绒毛的分别 n 取人足月胎盘，用注射器向脐带总动脉注取人足月胎盘，用注射器向脐带总动脉注入生

15、理盐水，并轻揉胎盘，直至洗尽血污，入生理盐水，并轻揉胎盘，直至洗尽血污，分别绒毛叶。分别绒毛叶。 3.2.2 分别纯化分别纯化 II) 提取提取n 未来自未来自100个胎盘的绒毛叶个胎盘的绒毛叶28kg剪碎，加剪碎，加20%v/w预冷的预冷的PBS(pH6.8，含，含lmmol/L EDTA)，匀浆，每次匀浆，每次3min，共，共3次。次。n 匀浆液在匀浆液在4C 8000r/min离心离心30min，上清以尼，上清以尼龙膜过滤，除去脂肪。龙膜过滤，除去脂肪。n 滤液中加尿素至滤液中加尿素至5mol/L，并调，并调pH至至4.0，静置，静置2h，以解离以解离hNGF高分子聚合体。高分子聚合体。

16、8000r/min离心离心30min，搜集上清液。，搜集上清液。 3.2.2 分别纯化分别纯化 III) 超滤分别超滤分别n上清液以分子量截留值为上清液以分子量截留值为30kD的超滤膜超的超滤膜超滤，滤液再用滤，滤液再用10kD的超滤膜超滤，当截留的超滤膜超滤，当截留液剩下约液剩下约1000ml时，在其中加时，在其中加pH4.0、50mmol/L NaAc-HAc(含含0.4mol/L NaCl)缓缓冲液冲液(平衡缓冲液平衡缓冲液)2000ml，再浓缩至，再浓缩至1000ml，反复反复5次，搜集截留液，对平衡缓冲液充分次，搜集截留液，对平衡缓冲液充分透析。透析。3.2.2 分别纯化分别纯化 I

17、V) 离子交换色谱纯离子交换色谱纯化化n 透析液上预先以平衡缓冲液平衡的透析液上预先以平衡缓冲液平衡的CM52离子交换离子交换纤维素纤维素(9.2cm30cm)柱，上完样后以平衡缓冲液柱，上完样后以平衡缓冲液洗脱穿过峰，换用洗脱穿过峰，换用pH9.0、50mmol/L Tris-盐酸缓盐酸缓冲液洗脱，最后以冲液洗脱，最后以pH9.0、含、含0.5mol/L NaCl的的50mmol/L Tris-盐酸缓冲液洗脱，搜集洗脱峰盐酸缓冲液洗脱，搜集洗脱峰(含含hNGF)。n 本制备工艺从本制备工艺从100个胎盘可提取纯化得个胎盘可提取纯化得hNGF约约148.6mg，比活约为，比活约为15000u/

18、mg；产品经；产品经SDS-PAGE银染显示其分子量约银染显示其分子量约14.4kD，为单一条带；经，为单一条带；经TSK2000SW HPLC层析得到单一峰。层析得到单一峰。包涵体包涵体n 多数重组蛋白表达产物是以不溶性表达产物存在多数重组蛋白表达产物是以不溶性表达产物存在于细胞内的，这种不溶性表达产物称为包涵体。于细胞内的，这种不溶性表达产物称为包涵体。这类产物的分别制备相对较复杂。这类产物的分别制备相对较复杂。n 包涵体根本上由蛋白质组成，其中大部分是克隆包涵体根本上由蛋白质组成，其中大部分是克隆基因表达产物，因无正确折叠的立体构造而没有基因表达产物，因无正确折叠的立体构造而没有活性。其

19、它成分有细胞活性。其它成分有细胞RNA聚合酶、膜蛋白、核聚合酶、膜蛋白、核糖体糖体RNA、质粒、质粒DNA和质粒编码蛋白以及脂质、和质粒编码蛋白以及脂质、肽聚糖、脂多糖等。肽聚糖、脂多糖等。(1) 包涵体的制备与处置包涵体的制备与处置n包涵体的制备主要包括菌体细胞的破碎与包涵体的制备主要包括菌体细胞的破碎与包涵体的洗涤与搜集两步。包涵体的洗涤与搜集两步。n菌体的破碎可用前面所述的各种方法，如菌体的破碎可用前面所述的各种方法，如超声波法。超声波法。n包涵体的洗涤与搜集普通采用含不同添加包涵体的洗涤与搜集普通采用含不同添加剂的磷酸盐缓冲液经过离心进展，搜集沉剂的磷酸盐缓冲液经过离心进展，搜集沉淀。

20、淀。 (2) 从包涵体中获取活性蛋白从包涵体中获取活性蛋白n 从包涵体中获取活性蛋白，需求对其进展处置。对包涵体从包涵体中获取活性蛋白，需求对其进展处置。对包涵体产物的处置包括三个步骤：产物的处置包括三个步骤：n 包涵体溶解前处置包涵体溶解前处置n 在变性条件下溶解包涵体可将表达产物变为可溶方式，以在变性条件下溶解包涵体可将表达产物变为可溶方式，以利于分别纯化。利于分别纯化。n 在溶解包涵体前，先用温暖外表活性剂在溶解包涵体前，先用温暖外表活性剂(如如Triton X-100)或或低浓度弱变性剂低浓度弱变性剂(如尿素如尿素)处置，除去脂质和部分膜蛋白，处置，除去脂质和部分膜蛋白，运用浓度以不溶

21、解包涵体中的表达产物为原那么。运用浓度以不溶解包涵体中的表达产物为原那么。(2) 从包涵体中获取活性蛋白从包涵体中获取活性蛋白n 包涵体溶解和表达产物变性包涵体溶解和表达产物变性n 溶解包涵体通常运用变性剂盐酸胍和尿素以及外溶解包涵体通常运用变性剂盐酸胍和尿素以及外表活性剂表活性剂SDS。这三种试剂溶解包涵体原理不同。这三种试剂溶解包涵体原理不同。n 盐酸胍和尿素破坏离子间相互作用，解除维系蛋盐酸胍和尿素破坏离子间相互作用，解除维系蛋白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的去折叠和白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的去折叠和变性，但它们不破坏共价键；变性，但它们不破坏共价键；n SDS主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用(2) 从包涵体中获取活性蛋白从包涵体中获取活性蛋白n 由于表达产物、宿主以及培育和诱导条件的差别，由于表达产物、宿主以及培育和诱导条件的差别