2019年王镜岩生物化学第三版考研笔记提要版本071

1、王镜岩生物化学第三版考研笔记（提要版本071页）内容提要：1、氨基酸与蛋白质氨基酸分类：常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸；氨基酸的酸碱化学，氨基酸两性解离，氨基酸的等电点；氨基酸的旋光性和紫外吸收。蛋白质的共价结构：蛋白质的化学组成和分类，蛋白质功能，蛋白质的形状和大小，蛋 白质构象和组织层次。肽：肽键结构，肽的物理化学性质，活性多肽。蛋白质一级2构测定：Sanger试剂，DNSi Edmar#解，二硫桥位置确定。蛋白质的三维结构：XRDg理；稳定蛋白质三维结构的作用力， 肽平面和两面角；蛋白质 的二级结构：a-螺旋，B-折叠片，B-转角；超二级结构和结构域；球状蛋白的三级结

2、 构；亚基缔合和四级结构。蛋白质结构与功能的关系：肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能，镰刀状细胞贫血病；免 疫球蛋白。蛋白质的分离、纯化和表征：蛋白质分子量测定，沉降分析及沉降系数，沉降系数单位， 凝胶过滤及SDS-PAG法测分子量；蛋白质的沉淀；电泳：区带电泳、薄膜电泳、等电聚 焦电泳、毛细管电泳。2、酶和辅酶酶催化作用特点：反应温合、高效、专一、可调节控制；酶活性调节控制：调剂酶浓度、激素调节、反馈抑制调节、抑制剂激活剂调节、别构调控、酶原激活，可逆共价修饰；酶的化学本质及其组成，辅酶和辅基，单体酶，寡聚酶和多酶复合体。酶的命名和分类：习惯命名法；国际系统命名法及酶的编号，六大类酶的特征。酶的

3、专一性：“锁与钥匙”学说；诱导楔合假说；过渡态理论，过渡态类似物与医药和农药的设计，催化抗体。酶的活力测定：酶活力单位，比活力。酶工程：化学修饰酶，固定化酶，人工模拟酶。酶促反应动力学：底物浓度与酶反应速度，酶促反应动力学方程式及推导，米氏常数的 意义和求法。酶的抑制作用：不可逆抑制和可逆抑制及动力学判断，一些重要的抑制剂，有机磷农药 和磺胺药作用机制。温度、PH激活剂对酶反应影响。酶的作用机制：酶活性部位及研究方法；影响酶催化效率的有关因素：临近和定向效应、底物形变和诱导契合、酸碱催化、共价催化、金属离子催化、多元催化和协同效应、微环境影响；溶菌酶作用机制和胰凝乳蛋白酶。辅酶的结构与活性部位

4、：vit.B i和TPP维生素PP和辅酶I、辅酶H, vit.B 2和黄素辅 酶，泛酸与辅酶A, vit. B 6及其磷酸酯，vit. B %生物素，叶酸，硫辛酸。3、氨基酸代谢氨基酸的脱氧、转氨和联合脱氨基作用，氨基酸脱竣基作用。尿素的形成：氨的转运和尿素循环。氨基酸碳骨架的氧化途径，生酮氨基酸和生糖氨基酸。由氨基酸衍生的生物活性物质：氨基酸与一碳单位，酪氨酸及儿茶酚胺类物质，色氨酸衍生物，组胺，牛磺酸。4、氨基酸及其重要衍生物的生物合成必需氨基酸；氨基酸的生物合成。氨基酸几种重要衍生物：NO的形成，谷胱甘肽，肌酸，血红素，胆红素。5、糖代谢糖的生物学作用：糖的结构特点和糖工程。糖酵解作用：

5、酵解和发酵，酵解全过程和反应步骤；酵解过程中能量转变的估算；丙酮 酸去路。柠檬酸循环：丙酮形成乙酰CoA柠檬酸循环概貌和反应步骤；柠檬酸循环的化学总结算。生物氧化一 电子传递和氧化磷酸化：氧化还原电势；电子传递和氧化呼吸链，电子传递抑制剂；氧化磷酸化作用，化学渗透假说，氧化磷酸化解偶联和抑制剂。戊糖磷酸途径及生理意义；葡糖异生作用及途径；糖原的分解与生物合成。6、脂质和生物膜脂质：脂肪酸结构特点，必需多不饱和脂肪酸。磷脂：甘油磷脂，卵磷脂，脑磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酰甘油，缩醛磷脂；鞘磷脂，鞘氨醇和神经酰胺。糖脂：脑甘脂，神经节甘脂。类固醇，胆固醇。生物膜的组成与性质：膜脂，胆固醇

6、对膜流动性的调节作用；膜蛋白功能和糖的细胞通信作用；生物膜分子结构的作用力和主要特征。生物膜与物质运输：被动运输与主动运输，钠钾泵，生物大分子跨膜运输。人工模拟膜：模拟膜的功能；模拟膜主要类型：LB膜，BLMW旨质体7、核酸核酸研究进展：生物技术的兴起，转基因产品，基因工程，基因芯片，人类基因组计划。 核酸的种类和生物功能。核酸的结构：碱基、核甘与核甘酸；核酸的共价结构，DN做螺旋结构，DNA勺拓扑异构,DNA勺四级2构；mRNAtRNA和rRNA的高级结构。核酸的物理化学性质：核酸的酶水解和核酸的酸碱性质，核酸的紫外吸收。核酸的变性，复性及杂交。8、核酸的降解核酸和核甘酸的分解代谢：喋吟碱的

7、分解，痛风病起因及别喋吟醇作用机制；喀呢碱的分解。核甘酸的生物合成：喋吟核糖核甘酸的从头合成及补救途径，抗癌和杀菌剂作用原理；喀噬环的合成；脱氧核糖核甘酸的合成，5-Fu和氨甲喋吟的抗癌作用机制。9、DNA勺复制和修复DNA勺复制：DNA勺半保留复制，复制叉；DN咪合酶及DN咪合要素，DNA!接酶和拓 扑异构酶。DNA不连续复制和冈崎片段；DNAM制的起始、延伸和终止；DNAS制的复杂性。DNA®伤修复：错配修复，直接修复，切除修复，重组修复和应急反应。10、RNA勺生物合成和加工DNA旨导的RNA成，RNA5合酶，不对称转录；启动子和转录因子，终止子和终止因子； 转录的调节控制，操

8、纵子模型；转录反应四阶段。RNAf£物合成的抑制剂：喋吟和喀呢类似物， DN徽板功能才制物，RNAK合酶抑制剂。RNA专录后加工：原核生物中RNA勺加工，真核生物RNA勺加工，RN即接、编辑和再编 码，酶性核酸；RNAf£物功能多样性。在RNA旨导下RN舟口 DNA勺合成：RNAE制和RNAW毒复制的重要方式，RNA勺逆转录和 逆转录酶。11、蛋白质生物合成遗传密码：三联密码，遗传密码的基本特性。蛋白质合成及转运：m-RN册蛋白质合成的模板，t-RNA转运氨基酸，核糖体是蛋白质合 成的工厂。翻译的步骤。蛋白质运输及翻译后修饰。12、基因工程DNA隆的基本原理：DNA艮制酶和

9、连接酶，克隆载体与宿主系统，外源基因导入宿主细胞，分离筛选及克Pi;基因文库和 c DNA文库。聚合酶链式反应：PCR1本原理,最适条件和发展应用。DNAff列的测定尺Z弟一早氨基酸与蛋白质上册P1231.1 氨基酸一）蛋白质水解最后成为氨基酸混合物酸水解碱水解酶水解示。(D1.按侧链R基不同进行分类 按R基化学结构分类 脂肪族氨基酸15个 .中性氨基酸5个甘氨酸 Glycine丙氨酸 Alanine缴氨酸 Valine氨基乙酸 Gly Ga-氨基丙酸 Ala Aa -氨基-B -甲基丁酸无旋光亮氨酸 Leusine 异亮氨酸 Isoleucine .含羟基或硫氨基酸4个丝氨酸 Serine苏

10、氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine 甲硫氨酸 Methionine氨基-Y -甲基戊酸Val VLeua -氨基-B -甲基戊酸-氨基-B-羟基丙酸 SerLIle Ia-氨基-B-羟基丁酸 Thr T口-氨基-0-基丙酸Cys Ca -氨基-y -甲硫基丁酸 Met M2.酸性氨基酸及其酰胺4个天冬氨酸 Aspartic acid 谷氨酸 Glutamic acid 天冬酰胺 Asparagine谷氨酸胺 Glutamine.碱性氨基酸2个赖氨酸 Lysine精氨酸 Arginine芳香族氨基酸3个a -氨基丁二酸 Asp Da-氨基戊二酸 Glu Ea -氨基丁二酸一酰胺

11、 Asn N a -氨基戊二酸一酰胺 Gln Qe -二氨基已酸 Lys K-氨基-6 -月瓜基戊酸 Arg R3.(2)1.苯丙氨酸 Phenylalanine酪氨酸 Tyrosine色氨酸 Tryptophan杂环族氨基酸2个组氨酸 Histidine脯氨酸 Proline按R基极性性质分类非极性R基8个a -氨基-B -苯基丙酸 a -氨基-B-对羟苯基丙酸 a-氨基-B-呷咪基丙酸a -氨基-B -咪口坐基丙酸 a -叱咯烷竣酸 Pro PPhe FTyrTrpHis得19种L-AA ,色氨酸破坏。 得色氨酸，其余氨基酸消旋破坏。不消旋破坏，但水解不彻底。二）a-氨基酸的一般结构生物体

12、内已发现氨基酸180种，常见氨基酸20种1.2氨基酸的分类：常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸一）常见蛋白质氨基酸，或称基本氨基酸。每个氨基酸可用三个字母或单字母简写表Ala(A) Val(V)Phe(F) Trp(W)Leu(L) Ile(I) Pro(P)Met(M)2 .极性不带电R基7个Gly(G) Ser(S) Thr(T) Cys(C) Tyr(Y)Asn(N) Gln(Q)3 .带正电荷R基3个Lys(K) Arg(R) His(H)4 .带负电荷R基2个Asp(D) Glu(E)另外 Asx(B) : Asp(D), Asn(N)Glx(Z) : Glu(E)

13、, Gln(Q)两个Cys常氧化形成胱氨酸Cystie(二)不常见蛋白质氨基酸P128为相应常见氨基酸修饰而来，如：5-羟赖氨酸，4-羟哺氨酸，T -竣基谷氨酸, 焦谷氨酸，磷酸丝氨酸，甲状腺素等。(三)非蛋白氨基酸 P1291. L型a-氨基酸衍生物 P1282. B、丫或6 -氨基酸3. D-氨基酸，如D-Glu和D-Ala常见有：肌氨酸(N-甲基甘氨酸)，B-丙氨酸，Y-氨基丁酸，瓜氨酸，鸟氨酸, 高半胱氨酸。1. 3氨基酸的酸碱化学(一)氨基酸两性解离-H+ -H +A+ tA . 0 . Ax -(质子供体r+h +H = (质子受体)Ka1 = A 0 H +/ A + pH=pK

14、 a1+lgA 0/ A +Ka2=A-H +/A 0pH=pKa2+lgA -/A 0综合pH=pH+lg质子受体/ 质子供体由此1.由pH值、AO/A+或A/A0测pKa2 .pKa为常数，由pH计算A0/A+或A7A03 .由质子受体/ 质子供体可计算pH(1)氨解酸的pKa测定甘氨酸解离曲线 P131 图3-91 mol Gly 溶于水，溶液pH=6.0用1 mol NaoH容液滴定得曲线B,消耗0.5mol时，在pH9.6处有一拐点，此时A0= A- pH=pK a2 测出 pG=9.6用1 mol Hcl滴定得曲线A,当消耗0.5 mol HCl时得一拐点，pH=p& 测出

15、pKa1=2.34带有可解离R基的氨基酸相当于三元酸，有三个pKa值，Glu和Lys滴定曲线见P132 图 3-10(二)等电点氨基酸或其他带电颗粒处于净电荷为零的兼性离子状态时介质的pH值，用pI表小，又称等电pH对于Gly , pI=5.97 ,为曲线A和曲线B之间的拐点，Gly为兼性离子，净电荷为等电点pH值计算：Pl = 1/2（PK a+） + pKa）Gly pI=1/2（2.34+9.60）=5.97对于带可解离 R基的氨基酸 如Asp的pKa, pKai=2.09 pK a2=3.86 pK a3=9.82等电点 pI p=1/2（ pK a+pK）=1/2（2.09+3.86

16、）=2.98同理推出Lys pI=9.74P133表3-3列出20种氨基酸的p（值和pI可做常数用，其中七个氨基酸R基有 pKa 值。1. 4氨基酸的光学性质（一）旋光性 一个无旋光Gly 17个含一个不对称碳原子，两个含两个不对称碳原子Thr和Ile ,有四种光学异构体。胱氨酸分子内部对称有内消旋体，有三种异构体。比旋光为氨基酸物理常数之一，但随pH值变化常见氨基酸比旋光度可用来鉴别氨基酸，P144表3-4（三）氨基酸的紫外吸收入 max(nm)6 （摩尔消光系数）Phe2572.0X102Tyr2751.4X103Tvp2805.6X103蛋白质在280nm®长下测光吸收，光吸收

17、值越大，相对纯度越高，常用在蛋白质提 纯过程。1 . 5蛋白质的共价结构（一）蛋白质 氨基酸首尾相连形成蛋白质。平均含氮量为16%蛋白质含量=蛋白氮X 6.25从细菌到人类所有物种的蛋白质都由这一组 20种氨基酸构成。1 .单纯蛋白质：仅由氨基酸组成，如核糖核酸酶，肌动蛋白等。见 P158表 4-1 。2 .缀合蛋白质：除氨基酸外，还有非蛋白部分，称为辅基或配基，如血红蛋白、核 蛋白、糖蛋白、脂蛋白等，见 P158表4-2。（二）蛋白质功能生物界蛋白质种类估计有10101012种，20种氨基酸全排列为Am=2020。1 .催化（酶）：生物体内化学反应几乎都是在酶催化下进行的。2 .调节：基因表

18、达调控中的蛋白因子，阻遏蛋白和激素中许多为蛋白质，如胰岛素3 .转运4 .贮存5 .运动6 .结构血红蛋白输氧气，细胞色素 C传递电子。如种子中谷蛋白，蛋中卵清蛋白。肌动蛋白，驱动蛋白。胶原蛋白，a -角蛋白。7 .信息传递：受体蛋白。8 .防御和进攻：免疫球蛋白，毒蛋白如蛇毒。9 .异常蛋白：胶质蛋白。（三）蛋白质的构象为蛋白质具有的特有空间结构或称三维结构。在生理条件下，蛋白质只有一种或 很少几种构象在能量上是有利的。功能来自构象：为表达蛋白质结构上不同组织层次，一般采用下列专门术语：1 . 一级结构：又称化学结构，指蛋白质多肽链氨基酸连接在一起的顺序，包括二硫键 位置，为共价键连接的全部

19、情况。2 .二级结构：多肽链借助氢键排列成自己特有的 a-螺旋和B-折叠片段（P161图 4-1）,这些片段构成规则结构，并沿一维方向伸展。3 .三级结构：由二级结构元件（a-螺旋，B-折叠等）构造成的总三维结构，包括一 级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间相互关系。4 .四级结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。寡聚蛋白是由两条或多条多肽链构成，其中每条多肽链称为亚基或亚单位。1.6 肽：P162肽为氨基酸的线性聚合物，蛋白质是由一条或多条多肽链构成。（一）肽和肽键结构肽的命名从N端开始到COO端，氨基酸残基按顺序从左向右写，-NH2末端在 左，

20、-COOHB在右。如Ser-Gly-Phe ,称为：丝氨酰甘氨酰苯丙氨酸。一般氨基酸数目<1220的肽为寡肽（小肽）；>20的肽为多肽。（二）肽的物理化学性质（1）与氨基酸同，为离子晶格，熔点高，在水溶液中以偶极离子存在。多肽中酰胺 的氢不易解离，肽的酸碱性质主要取决于游离末端的 a-氨基和a-竣基，以及 侧链R基上的可解离基团，如 Glu的Y -COOH Lys的e -NH2。（2）滴定曲线：也有等电点，为多价离子等电点。以 Gly-Glu-Lys-Ala 四肽为例 （P166 表 4-6）: 当pH <3.5,末端可解离基团全部质子化，2个+NH、2个COOH净电荷+2;

21、 pH3.5-4.5 , C-末端 COOH单离（pKa=3.7）,为 2 个+NH、一个 COOH一个 COQ 净电荷+1; pH 4.57.5 , Glu 的 丫-COOHS离,2 个+NH、2 个 COQpKa=4.6）,为等电点， 净电荷为0; pH7.810.2, N末端-+NH解离（p（=7.8 ）, 一个+NH、一个 NH、2 个 COO 净电荷-1 ; pH>10.2, e-+NH解离，2 个 NH、2 个 COQ 净电荷-2。pH在等电点以上（碱性），多肽带负电荷。pH在等电点以下（酸性），多肽带正电荷。蛋白质滴定曲线更加复杂。（3）化学反应 与西三酮在弱酸性溶液中共热

22、显紫色，为 a-NH反应（注意：伯胺也可使西 三酮显紫色），氨基酸、多肽均有此反应。Pro为仲胺（亚氨基氨基酸），与西 三酮生成黄色物质。西三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。 肽键的双缩月尿反应：多肽，蛋白质中有肽键，有此反应，氨基酸没有此反应。双缩胭：H2N-CO-NH-CO-NH P163双缩月尿反应：含有两个或两个以上肽键的化合物（如双缩月尿或二肽以上等 多肽）在碱性溶液中能与 CuSOf£成紫红色或紫蓝色复合物，可定性或定量测 定蛋白质含量，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。(三)活性多肽：动植物体内存在许多具有生理活性的多肽，多肽药物已获得人们的重视。二肽：肌肽B-Ala

23、-His ,抗氧化，抗自由基，消炎，调节免疫。甜二肽 Aspartame Asp-Phe-OCH 3,比蔗糖甜 200 倍。三肽：谷胱甘肽 丫-Glu-Cys-Gly ,维持红细胞及其蛋白质中 Cys的-SH处于还原四肽：促胃酸激素。五肽：脑啡肽，内源性吗啡，与吗啡受体结合。蛋氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPheMet 。亮氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheLeu 。八肽：a-鹅膏蕈碱，见P168图4-6,剧毒毒素。九肽：牛催产素，牛加压素(升高血压)，见P167,两者只差两个氨基酸，但生 理作用极不相同。十肽：短杆菌肽，见P532,为抗生素。促黄体生成激素释放因子，见 P551,为激素。十六

24、肽：内啡肽，有镇痛作用。二十四肽：促皮质素(ACTH,治关节炎，已商品化。二十六肽：蜂素溶血肽，抗关节炎。五十一肽：胰岛素，降血糖。以活性多肽研究为基础的药物研究：血管紧张素转化酶(ACE抑制剂(ACED的开发是近代高血压治疗史上的重大进展。人体内存在的血管紧张素I ( Angl)为十肽,无活性，但在 ACE乍用下转化为血管紧张素R ( AngH)为八肽,具有收缩血管平滑肌作用，使血压升高。ACEDRVYIHPFHL(Ang I )DRVYI IPF(AngH )。ACEI可使ACE失活，使Angl不能形成AngH,从而降血压，研究 AngI活性部位，作用机理，进而设计并合成ACEI,已开发出

25、二十多种降压药物，如琉甲丙脯酸(Captopril )、依那普利(Enalapril )、赖诺普利(Lisonopril )等。1.7 蛋白质一级结构测定：P168测定蛋白质中共价键连接的全部情况，包括存在的链内、链间的二硫键位置，氨基 酸数目、类型和顺序。蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构，而三维结构决定其生物活性和功能。蛋白质中 氨基酸顺序是由基因决定的，是联系 DNAS传信息和蛋白质生物功能的桥梁。蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史， 具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基酸顺序。 如细胞色素C (P182),是一种含血红素的电子转运蛋白，存在于所有真核生物的线粒体 中。40多种物种的细胞色素C序列

26、的研究揭示，在细胞色素 C中含有的一百多个氨基酸 残基，其中有28个位置上的氨基酸残基是相同的(P182图4-16),这些不变残基对于细 胞色素C的生物学功能至关重要，由此可根据细胞色素 C序列的物种差异建立进化树 (P183图4-17)。来自任两个物种的细胞色素 C间序列的氨基酸差异数目越多则进化位 置相差越远。(一)蛋白质测序样品纯度应97%测分子量(允许误差10%。1 .蛋白质分子中多肽链的数目：测N-末端和C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋白要用变 性剂将亚基拆开。2 .每一多肽链氨基酸组成：鉴定N-末端残基和C-末端残基，定出氨基酸序列参考点。3 .按专一方式断裂成较小的肽片段：可用酶或化

27、学方法完成，并用多种断裂方法， 将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。4 .侧各肽段氨基酸序列：常用EdmarW解法，用自动序列分析仪。5 .测定片段次序：用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。6 .确定二硫键位置。（二）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定（1） N-末端分析二硝基氟苯（DNFEBE FDNB法：Sanger反应。2、4-二硝基氟苯称为Sanger试剂，与游离末端氨基反应生成 DNP多肽或DNP- 蛋白质，再酸性水解生成DNP氨基酸（黄色），提取分离后可进行鉴定和定量测定。此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。 丹磺酰氯（DNS法：有荧光，灵敏度

28、高。5-二甲氨基-奈-1-磺酰氯（DNS,结 构式见1700Eman降解苯异硫氟酸酯（PITC）法：Phenylisothiocyanate（PITC） 能顺序从肽的N-端将 氨基酸残基一个个切下来，还可用来测定氨基酸序列。PITC与多肽链每反应一次,得到一个 PTH-M基酸和少一个氨基酸残基的肽。PTH （phenylthiohydantoin）: 苯乙内酰硫月尿。PTH-M基酸可用 TLC或 HPLC 快速测定，由此发展出氨基酸序列自动分析仪。氨肽酶法：用外切酶，从N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶，适用于 N-末端残 基的氨基酸被封闭的肽（如环肽）；N-末端是焦谷氨酸残基时，可使用

29、焦谷氨酸氨 肽酶。（2） C-末端分析 肌解法：蛋白质或多肽与无水肌加热发生肌解反应，除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肥化物。肌进攻肽键而不易与-COOH反应，肌解中Gln、Asn、Cys被破坏。还原法：用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇，肽水解后可分离、鉴定。竣肽酶法：专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸，P171图4-7。 （三）二硫键断裂：用变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸月瓜使蛋白质变性，分子内部-S-S-露出， 并用HSC2CHOHE理，则-S-S-变成2个-SH,再用碘乙醇保护-SH不被氧化，P172 图 4-8 0也可用

30、过甲酸氧化，将-S-S-变成2个磺酸基。（四）氨基酸组成分析：可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解（6mol/L HCl）,再用碱水解 测 Trp。测出Asx和Glx,酰胺基总量由水解液中NHCl量计算出。P172表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成。（五）多肽链部分裂解成小肽段，分别测序：现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段，需将蛋白质先裂解成较小肽段，分离后测序。（1） 酶裂解法：常用的蛋白酶有以下几种（为内切酶）：胰蛋白酶：水解碱性氨基酸的竣基所形成的肽键，如 Lys, Arg。糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：肽键竣基端为芳香族氨基酸，如 Phe Trp、或Tyr,以及疏水氨基酸 Leu、

31、Met或His。胃蛋白酶：特异性不太强，切点多，肽键竣基端为芳香族和疏水氨基酸。（2）化学裂解法：澳化氟BrCN断裂竣基端为Met的肽键，反应见P175图4-10, 生成肽酰高丝氨酸。（六）肽段氨基酸序列测定（2） Edman化学降解法：每反应一次生成一个PTH-AA层析分离、鉴定，剩下减少一个残基的肽链， 又有新N-端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分析，进行几轮反应 就能测出几个残基序列。最低样品用量仅 5 pmol。Edman降解现已有多种改进。如 DNS-Edma测序，可提高灵敏度；试剂的 改进，用由荧光基团或有色基团标记的 PITC可更灵敏。（2）质谱法：电喷射电离（ESI）,

32、见P178图4-11。使蛋白质离子解吸进入气相， 15肽以下均可用。（七）肽段在多肽链中次序确定用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段，由于切口错位，可由重迭肽（两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段）确定肽段先后次序，从而拼 凑出整个多肽链的氨基酸序列。P179图4-12。（八）二硫桥位置的确定用切点多的胃蛋白酶水解肽链，生成比较小的含二硫桥的肽段混合物，将样 品点在滤纸中央，在pH6.5进行第一向电泳分离。然后用过甲酸蒸气熏，-S-S-氧 化断裂成两个含磺酰丙氨酸（带负电荷）的肽。将滤纸转90°,在完全相同条件下再进行第二向电泳，大多数肽段迁移率未变，位于滤纸对角线上，而

33、含磺酰丙氨 酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线（向正极向）,见P178图4-13。将每对含磺 酰丙氨酸的肽段分别取下，进行氨基酸序列分析，推出二硫桥的位置（肽链内或 肽链问）。现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核甘酸顺序推定的，但仍需氨 基酸序列分析配合。§1.8 蛋白质的三维结构 P197 第5章蛋白质三维结构由氨基酸序列决定，且符合热力学能量最低要求，与溶剂和环境有 关。 主链基团之间形成氢键。 暴露在溶剂中（水）的疏水基团最少。 多肽链与 环境水（必须水）形成氢键。（一）研究蛋白质构象的方法（1） X-射线衍射法：是目前最明确揭示蛋白质大多数原子空间位置的方法，为研究蛋 白

34、质三维结构最主要的方法。步骤为：蛋白质分离、提纯-单晶培养-晶体学初步鉴定-衍生数据收 集结晶解析结构精修结构表达。（2）其他方法：NMR紫外差光谱、荧光和荧光偏振、圆二色性、二维结晶三维重构。（二）稳定蛋白质三维结构的作用力（1）弱相互作用（或称非共价键，或次级键）1 .氢键 2.疏水作用（嫡效应）3.范德华力4. 离10子键（盐键）（2）共价二硫键（三）酰胺平面和二面角 P 205 图5-11（1）酰胺平面（肽平面）：肽键上的四个原子和相连的 Ca 1和C”2所在的平面。（2）两面角：每个氨基酸有三个键参与多肽主链,一个肽键具有双键性质不易旋转, 另两个键一个为Ca 1与好基形成的单键，可

35、自由旋转，角度称为 山，另一个为 NHf C“2形成的单键也可自由旋转，角度称为小，山和小称为二面角或构象角， 原则上可取-1800+18C0之间任意值（实际受立体化学和热力学因素所限制）， 肽链构象可用两面角巾和小来描述，由巾和小值可确定多肽主链构象。（四）二级结构 P207多肽链折叠的规则方式，是能量平衡和嫡效应的结果。主链折叠由氢键维持（主要），疏水基团在分子内，亲水基团在分子表面。常见的二级结构元件：a-螺旋，B-折叠片，B-转角和无规卷曲。（1） a-helix :蛋白质含量最丰富的二级结构。肽链主链围绕中心轴盘绕成螺旋状紧密卷曲的棒状结构，称为a-螺旋。1 .两面角 山和小分别在-

36、570和-470附近（小：从C“向N看，顺时针旋转为正，逆 时针为负；巾：从C“向好基看，顺时针为正，逆时针为负。）2 .每圈螺旋含约3.6个氨基酸残基，由H键封闭的环中原子数为13,此种a-螺旋 又称3.6 13-螺旋，每周螺距为0.54nm, R基均在螺旋外侧，P208图5-14。3 . a-螺旋本身是一个偶极矩，N-末端带部分正电荷，C-末端积累部分负电荷；a- 螺旋几乎都是右手螺旋而有手性，并有旋光性，可用圆二色性（ CD光谱研究。4 .影响a-螺旋形成的因素：R基小且不带电荷，易形成a-螺旋。如Poly Lys在PH7时，R基带正电荷，静电排斥，不易形成 a-螺旋，但若 PH=12消

37、除R基正电荷可形成a-螺旋。Poly Ile 由于R基大，虽不带电也不易形成。Pro由于无酰胺H,不能形成链内氢键，所以当Pro和羟脯氨酸存在时，a- 螺旋中断，产生一个结节。（2） B-折叠片：第二种常见的二级结构两条或多条相当伸展的多肽链侧向通过氢键形成的折叠片状结构，如 P210 图 5-17。肽链主链呈锯齿状，肽链长轴互相平行。氢键：在不同的肽链间或同一肽链的不同肽段间形成，氢键与肽链长轴接近垂直。R基：交替分布在片层平面两侧。有两种类型：平行结构（相邻肽链同向）和反平行结构（相邻肽链反向），见P210 图 5-18。（3） B-转角和B-凸起B -转角是球状蛋白的一种简单的二级结构元

38、件。为第一个氨基酸残基的好 基与第四个残基的N-H氢键键合，形成一紧密的环在肽链回折或弯曲时形成，使 多肽链出现1800急剧回折，见P211图5-19。B -转角处Gly和Pro出现几率很高。B-凸起：是在B-折叠股中额外插入一个残基，凸起股产生小弯曲（P212 图5-20）,可引起肽链方向稍有改变。（4）无规卷曲：泛指那些不能归入明确的二级结构的多肽区段，实际上不是完全无规，11而是像其他二级结构那样具有明确而稳定的结构。常构成酶的活性部位和蛋白质的功能部位。（五）超二级结构若干相邻的二级结构单元彼此相互作用，形成种类不多、有规则的二级结构 组合或二级结构用，在多种蛋白质中充当三级结构的构件

39、，如P221图5-29所示,有 a a , 0 a 0 等。（六）结构域多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成的三级结构（局部折叠区），是相对独立的紧密球状实体，称为结构域或域，是球状蛋白质的独立折叠单位。对于较小的球状蛋白质分子或亚基，结构域就是三级结构；对于较大的球状蛋白 之或亚基，其三级结构往往由两个或多个结构域缔合而成，为多结构域。结构域形成再缔合成三级结构动力学更为合理， 特定三维排布的结构域形成， 有利于结构域之间活性中心的形成，结构域之间的柔性肽链形成的银链区有利于 活性中心与底物结合，以及别构中心结合调节物发生别构效应。（七）球状蛋白质的三级结构球状蛋白质三级结构具有明显的折叠

40、层次：二级结构超二级结构-结构域三级结构 四级结构（多聚体）。分子是紧密球体或椭球状实体，所有原子体积占7277%空腔约25%疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面，球状蛋白是水溶性的。球状蛋 白表面上的疏水空穴常用于结合底物、效应物等配体，为行使生物功能的活性部 位。（八）蛋白质折叠和结构预测（1）蛋白质变性：天然蛋白质分子受某些物理化学因素， 如热、紫外线照射或酸、碱、 有机溶剂、变性基的影响生物活性丧失，溶解度降低及物理化学常数改变的过程 称为蛋白质变性。蛋白质变性为分子中次级键破坏，天然构象解体，但变性不涉及共价键（肽 键和二硫键）的破裂，一级结构保持完好，只是物化性质和生化性

41、质改变。变性剂：能与多肽主链竞争氢键，破坏二级结构，如尿素、盐酸月瓜等；表面活性剂：破坏蛋白质疏水相互作用，使非极性基团暴露于介质水中，如 十二烷基硫酸钠。变性是一个协调过程，在所加变性剂很窄的浓度范围内，或很窄的 pH或温 度区间内突然发生。（2）氨基酸序列规定蛋白质的三维结构核糖核酸酶的变性和复性试验：牛胰核糖核酸酶，为124个氨基酸残基组成单链，包含四个二硫键。变性：加8mol/L尿素或6mol/L盐酸月瓜和琉基乙醇（还原二硫键），酶变性, 紧密结构伸展成松散的无规卷曲构象。复性：将尿素等变性剂和琉基乙醇用透析法除去，酶活性又可恢复，最后达原活性的 95100% P235 图 5-49。

42、加入极微量琉基乙醇，有助于二硫键重排，加速酶的复性。复性：变性的蛋白质在一定条件下重建其天然构象恢复其生物活性。蛋白质天然构聚处于能量最低状态， 理论上变性是可逆的，但实际上由于复性所 需条件复杂，不易满足而常常遇到困难。12根据分子生物学一个中心原理：顺序规定构象，活性依靠结构，蛋白质结构 是可预测的。全新蛋白质设计和蛋白质工程更需要蛋白质结构预测。（九）亚基缔合和四级结构（1）蛋白质四级结构涉及亚基种类和数目，以及亚基在整个分子中空间排布（对称性），亚基的接触位点（结构互补）和作用力（主要是非共价相互作用）。大多数寡聚蛋白质分子亚基数目为偶数，亚基种类一般是1或2种。（2）四级结构缔合的驱

43、动力：弱相互作用（氢键、疏水相互作用，范氏力，盐键） ， 有的亚基聚合还借助亚基之间的二硫桥，如抗体是由两条重键和两条轻链组成的 四聚体，二硫键将两条重链与轻链连接在一起，P276图6-29。（3）亚基缔合方式：亚基缔合主要是疏水相互作用， 缔合专一性则由表面的极性基团 的氢键和离子键提供。许多蛋白质借异种缔合（相同亚基，但相互作用表面不同）。形成线性或螺 旋形的大聚合体，如病毒颗粒外壳，P248图5-56显示人免疫缺陷病毒（HIV-I ） 的核壳由几百个外壳蛋白亚基组成。（4）四级结构对称性：是四级结构蛋白主要性质之一，有旋转对称轴，如二聚体，四 聚体。（5）四级缔合在结构和功能上具有优越性

44、： 可增强结构稳定性，提高遗传经济性和效 率，使编码所需DNAM少，可使催化基团汇集在一起；具有协同性和别构效应。别构效应：多亚基蛋白质一般具有多个结合部位， 结合在蛋白质分子的特定 部位上的配体对该分子和其他部位所产生的影响（如改变亲和力或催化能力） 称为别构效应。具有别构效应的蛋白质为别构蛋白质，酶称为别构酶，具有调节代谢的功能。1.9 蛋白质结构与功能的关系：P252, 第六章从厌氧生物转化为好氧生物是生物进化中的一大进步。脊椎动物中血红蛋白在血液 中起到载氧和输氧的作用，肌红蛋白在肌肉中起贮氧和氧在肌肉中分配的作用。（一）肌红蛋白（Mb的结构与功能（1） 三维结构：由一条多肽链和一个血

45、红素辅基构成， 相对分子量16700,含153 个氨基酸残基。分子中多肽链由8段a-螺旋组成，分子结构致密结实，带亲水基 团侧链的氨基酸分布在分子外表面，疏水氨基酸侧链几乎全埋在分子内部，见P253 图 6-1 o（2） 辅基血红素：由二价铁和原吓咻IX组成，原吓咻IX由4个叱咯环组成，见P254 图 6-2。铁原子只有亚铁态的蛋白质才能结合氧。 蛋白质提供疏水洞穴，固定血红素基， 保护血红素铁免遭氧化，为氧提供一个结合部位。结合氧只发生暂时电子重排。（二）血红蛋白（Hb）的结构与功能（1） 血红蛋白由4个多肽链（亚基）组成，如a 20 2 （成人血红蛋白HbA,每个 亚基都有一个血红素基和一

46、个氧结合部位，a -链有141个残基，B -链有146个残基，且a链、B链和Mb的三级结构都非常相似（P259图6-9）。实际上对于人 的这三种多肽链分析发现只有 27个的残基是共有的，这表明蛋白质高级结构的保 守性。只要功能相同（都与氧结合），高级结构就相似，有时甚至是唯一的。血红蛋白与肌红蛋白结构上最大不同在于血红蛋白有四级结构，是四聚体，而肌红蛋白只有三级结构。因此血红蛋白运载氧能力增强，还能运载H>DCO,在氧分压变化不大范围内完成载氧和卸氧工作。且 Hb为变构蛋白，可受环境中其他 分子，如H+, CO和2, 3-二磷酸甘油酸（BPG的调节。13(2)氧结合引起血红蛋白构象变化，

47、氧合血红蛋白和去氧血红蛋白在四级结构上有 显著不同，发生构象变化。氧与血红蛋白结合是协同进行的，具有正协同性同促效应，即一个氧分子与 Hb结合，使同一 Hb分子中其余空的氧结合部位对氧亲和力增加，再结合第二、三、四个氧分子则比较容易。(3) Hb和MbM合曲线如P262图6-14所示。P(O):氧分压，表示氧的浓度(氧浓度与氧分压成正比)。Y:氧饱和百分数，为被占氧合部位与氧合部位总数之比。当丫=0,所有氧合部位空着；丫=1,所有氧合部位被氧占据；丫=0.5,半载，此 时所需氧分压大小为对氧亲和力指标。Mb®合曲线为双曲线；Hb氧合曲线为S型曲线。S曲线分析： 肺区氧分压较高，P (

48、Q)约为100torr (空气中氧分压 760x21%=160torr), Y=0.97,近于1,载氧。 组织肌肉中需氧，P (Q)约为20torr , Y=0.25,卸氧。AY:氧饱和百分数变化；AP (Q):氧分压变化。肺区和组织肌肉中氧分压变化： A P (Q) =100-20=80torr , Hb氧饱和百分数变 化为，A Y=0.970.25=0.72 ,表示有近3/4氧可从Hb上卸下。由此可知在 S 曲线上，即使P (Q)变化不大(仅80torr ),也有较多的氧卸下，输氧效率较 高，可完成输氧，AP (Q)在20100torr范围变化，为Hb工作区；相比Mb的 双曲线，AP (Q

49、)在20100torr范围变化，AY只有0.1 ,表示氧不易卸下， 只能担负贮氧功能。Hb与Mb功能差别只是因为Hb有四个亚基，有四级结构，可进行协同载氧 和卸氧工作，Mb只能贮氧。(4) H+, CO和BPG(2, 3-二磷酸甘油酸)对血红蛋白结合氧的影响：它们与Hb结合部位离血红素基甚远，是通过别构效应调节Hb与氧的结合。1 .波尔效应(Bohr):pH降低(H+增力口)，CO压力增加均降低血红蛋白对氧亲和力，促进血红蛋白释放氧；反之高浓度氧又促使脱氧血红蛋白释放H和CO。P264图6-17: pH减少使S曲线右移，而M增加、CO增加均使pH减少。生理意义：在组织区CO产生，为高CO区，p

50、H约7.2,有利于Hb释放氧， 载CO;在肺区氧吸入，pH约7.6,有利于Hb与氧结合，放出CO。2 . BPGH氐Hb对氧亲和力：BPG由糖代谢产生，正常人血液中约含 4.5mmol/L,约与血红蛋白等摩尔 数。P265图6-19显示出在不同BPGG&度下血红蛋白的氧合曲线，BPGS度增力口， Hb氧合曲线右移。无BPG Hb氧合曲线为双曲线，不易卸氧；当BPG=4.5mmol/叫(正常生理状况)，为S型曲线，可卸氧，止匕时P (O) =26torr , Y=0.5; 当BPG=7.5mmol/L寸(非正常生理状况如高山反应，及病理状况如肺气月中)， S曲线右移，更易卸氧，满足肌体对

51、氧需求，此时 P (Q)为34torr , Y=0.5。 (三)血红蛋白分子病人类已发现300多种不同突变的血红蛋白，许多突变是有害的，产生遗传病，14如镰刀状细胞贫血症：病状：贫血症；检查：血液中含大量镰刀形红细胞 HbS没有足够可承担输氧的正常圆形细胞 HbA镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。研究：电泳发现HbS和HbA电泳速度和等电点均有差异。在 pH8.6下均向正 极移动，但HbS比HbAW慢，说明HbS比HbA少几个带负电荷基团。氨基酸测序发现HbA与HbS区别在于B -链上6-位Glu（HbA变为Val（HbS , 结果由于疏水相互作用，B -链上6-Val与1-Val接近

52、，使血红蛋白分子从扁平 状压缩变形，形成细长聚集体红细胞，构成镰刀形，与氧结合力降低。值得注意的是血红蛋白分子四条肽链共 574个氨基酸残基，只两个B-链上 的氨基酸被代替（2Glu- 2Val）,即引起如此严重疾病。1.10 蛋白质分离和纯化P290 7 章（一）蛋白质分子量测定：（1）根据化学组成测最低分子量：1 .肌红蛋白、血红蛋白均含铁 0.335%,分别求它们的最低分子量：肌红蛋白为55.8 （Fe原子量）+ 0.335 X100=16700,与其他方法测分子量相 符。血红蛋白含铁也是0.335%,最低分子量也为16700,但用其他方法测分子量 为68000,即每一个血红蛋白含有4个

53、铁原子，由此计算更为准确分子量为：16700 X 4=66800=2 .由氨基酸含量计算：如牛血清清蛋白含Trp0.58%,蛋白质最低分子量为35200;每一牛血清蛋白 含有2个Trp,所以分子量为70400,比其他方法测出的准（69000）。（2）沉降系数和沉降系数单位：蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时，蛋白质分子沉降，沉降速度与蛋 白质分子大小和密度、分子形状等有关，可用于测分子量。沉降系数：蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值，称为沉降系数或沉降常数用s表示。s常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系 数介于 1乂10-13至1 200X 10-13se

54、c 范围,见 293 表 7-4。为方便起见，把10-13sec作为一个单位，称为svedberg （斯维得贝格）单位或 沉降系数单位，用S表示，如人的Hb沉降系数为4.46S,即为4.46 X10-13sec。（二）蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀：蛋白质溶液属胶体系统，分散相质点大小1100nm蛋白质可用盐析，有机溶剂沉淀，生成重金属盐、加生物碱和某些酸类（如三氯乙酸）进行沉淀；蛋白质加热变性也会沉淀。（三）蛋白质的分离纯化：（1） 前处理：将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释放出来，并保持天然状态，不丢失生物活性，如用适当缓冲液提取蛋白质，离心除去杂质。（2） 粗分离：将蛋白质

55、提取液中所需要的蛋白分出，除去其他杂蛋白、核酸和多糖等。1 .等电点沉淀和pH控制：等电点沉淀：改变蛋白质溶液pH,使蛋白质净电荷为零处于等电点，相邻蛋 白分子间无静电斥力，溶解度最低，蛋白保持天然构象聚集沉淀。15P305图7-10 pH和离子强度对B-乳球蛋白溶解度的影响，等电点为pH5.25.3,溶解度最低。由于不同蛋白有不同等电点，也可将一些蛋白质混合物分开。2 .盐溶和盐析：盐析：当溶液中盐浓度增大，离子强度达一定数值时，蛋白质溶解度下降并 进一步析出。盐析蛋白保持天然构象，能再溶解。一般用硫酸钱盐析，硫酸钱在水中溶解 度高，且溶解度的温度系数较低。盐溶：当加入低浓度中性盐时，蛋白质

56、溶解度增加。（3）细分级分离：一般用层析法和电泳法。1 .电泳：在外电场作用下，不处于等电状态的带电颗粒（如蛋白质分子）将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。电泳迁移率或泳动度（以）：为单位电场强度下，蛋白质分子在溶液中的移动 速度。叱=u/E u :颗粒泳动速度，E:电场强度常用的电泳种类： 区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物被分离成若干区带。薄膜电泳：使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。 凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE。毛细管电泳（HPCE：毛细管散热好，有助于消除热引起的对流和区带变宽；系统高分辨力，进样量少，可分离手性化合物。 等电聚焦电泳：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成p