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1、真核生物的启动子有其特殊性，真核生物有三种真核生物的启动子有其特殊性，真核生物有三种RNA聚合酶，每一种聚合酶，每一种都有本人的启动子类型。以都有本人的启动子类型。以RNA聚合酶聚合酶的启动子构造为例，人们比的启动子构造为例，人们比较了上百个真核生物较了上百个真核生物RNA聚合酶聚合酶的启动子核苷酸序列伯发现；在的启动子核苷酸序列伯发现；在-25区有区有TATA框，又称为框，又称为Hogness框或框或Goldberg-Hogness框。其一框。其一致序列为致序列为T28A97A93A85A63T37A83A50T37，根本上都由，根本上都由A，T碱基碱基所组成，实验阐明，所组成，实验阐明，T

2、ATA框决议了转录起点的选择，天然短少框决议了转录起点的选择，天然短少TATA框的根本可以从一个以上的位点开场转录。在框的根本可以从一个以上的位点开场转录。在-75区有区有CAAT框，其一框，其一致的序列为致的序列为GGTCAATCT。有实验阐明。有实验阐明CAAT框与转录起始频率有关。框与转录起始频率有关。三原核基因转录的起始三原核基因转录的起始原核生物转录起始可分为四个阶段：原核生物转录起始可分为四个阶段： 中心酶在中心酶在因子参与下接触到因子参与下接触到DNA上；上；RNA聚合酶识别启动子并与之结合，构成封锁性的起始复合物；聚合酶识别启动子并与之结合，构成封锁性的起始复合物；酶结合在酶结

3、合在-10区，启动子活化；然后解开双链，暴露模板链；区，启动子活化；然后解开双链，暴露模板链；酶挪动到转录起始位点，加上第一个核苷三磷酸，构成三元复合物，酶挪动到转录起始位点，加上第一个核苷三磷酸，构成三元复合物，转录开场。转录开场。 四真核基因转录的起始四真核基因转录的起始真核生物转录起始非常复杂，往往需求多种蛋白因子的协助，曾经知道，在一真核生物转录起始非常复杂，往往需求多种蛋白因子的协助，曾经知道，在一切的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与切的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与RNA聚合酶聚合酶构成转构成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。录起始复合物，共同参与转

4、录起始的过程。 真核生物基因中，有专门为蛋白质编码的基因，这些基来由真核生物基因中，有专门为蛋白质编码的基因，这些基来由RNA聚合酶聚合酶担担任进展转录起始关键性作用。根据这些转录因子的作用特点可大致分为二类；任进展转录起始关键性作用。根据这些转录因子的作用特点可大致分为二类；第一类为普遍转录因子，它们与第一类为普遍转录因子，它们与RNA聚合酶聚合酶共同组成转录起始复合物，转共同组成转录起始复合物，转录才干在正确的位置上开场。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的，其录才干在正确的位置上开场。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的，其中包括特异结合在中包括特异结合在TATA盒上的蛋白质，叫做盒上的

5、蛋白质，叫做TATA盒结合蛋白，还有至成一盒结合蛋白，还有至成一组复合物叫做转录因子组复合物叫做转录因子D。TFD再与再与RNA聚合酶聚合酶结合完成转录起始复结合完成转录起始复合物的构成。合物的构成。除除TFD以外，在细胞核提取物中还发现以外，在细胞核提取物中还发现TFA，TFF，TFE，TFH等，等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用，像它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用，像TFH就有旋转酶活性，就有旋转酶活性，它可利用它可利用ATP分解产生的能量，介导起始点双螺旋的翻开，使分解产生的能量，介导起始点双螺旋的翻开，使RNA聚合酶得聚合酶得以发扬作用。从中也不难看出真核细胞中基因转

6、录的起始是基因的表达调控以发扬作用。从中也不难看出真核细胞中基因转录的起始是基因的表达调控的关键，这么多蛋白质分子之间相互作用，以及这些蛋白质分子的关键，这么多蛋白质分子之间相互作用，以及这些蛋白质分子DNA调控元调控元件相结合，构成控制基因转录开场的复杂体系。件相结合，构成控制基因转录开场的复杂体系。 第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子，这此第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子，这此TF是在特异的组织细胞或是遭到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，是在特异的组织细胞或是遭到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开场表达某些特异蛋白质分子时，

7、才需求的一类转录因子。开场表达某些特异蛋白质分子时，才需求的一类转录因子。 一原核生物一原核生物mRNA的特征的特征1 原核生物的mRNA半衰期短2 许多原核生物mRNA以多顺反子的方式存在3 原核生物mRNA5端无帽子构造，3端没有或只需较短的poly(A)构造。原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进展的，蛋白质合成往往在mRNA刚开场转录是被引发了。一个原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以编码几个多肽，而一个真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽。1 半衰期较长，几乎都是单顺反子的方式存在2 真核生物的mRNA的5端存在帽子构造。帽子构造能

8、够使mRNA免遭核酸酶的破坏。mRNA的帽子构造经常被甲基化3 绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾巴真核细胞mRNA的最大特点在于它往往以一个较大分子质量的前提RNA出如今核内，只需成熟的，相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才干进入细胞质，参与蛋白质的合成。所以，真核细胞的mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范筹内。二二 真核生物真核生物mRNA的特征的特征3.4 原核生物与真核生物原核生物与真核生物mRNA的特征比较的特征比较一一 RNA中的内含子中的内含子 断裂基因：断裂基因的存在阐明真核细胞的基因构造和mRNA合成过程比原核细胞要复杂的多，由于真核基因的表达往

9、往伴随着RNA的剪接过程，从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接构成成熟mRNA。真核基因大多是断裂的，也就是说一个基因可由多个内含子和外显子间隔陈列而成。 外显子：编码蛋白质的序列。 内含子：初级转录产物hnRNA加工产生成熟mRNA时被切除的间隔序列。研讨阐明，内含子在真核基因中所占的比例非常高，甚至超越99%。3.5 内含子的剪接编辑及化学修饰内含子的剪接编辑及化学修饰 研讨阐明，许多相对分子质量较小的核内RNA以及与 这些RNA相结合的核蛋白(被称为snRNPs)参与RNA的 剪接。mRNA链上每个内含子的5和3段分别与不 同的snRNPs相

10、结合，构成RNA和RNP复合物。 在高等真核生物中，内含子通常是有序或组成性地从 mRNA前体中被剪接，然而，在个体发育或细胞分化 时可以有选择地越过某些外显子或某个剪接点进展变 位剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA，称为 内含子的变位剪接。 普通情况下，由u1snoRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5剪接点，由结合在3剪接点上游富嘧啶区的u2AF识别3剪接点，并引导u2snRNP与分支点相结合，构成剪接前体，并进一步与 u4、 u5、 u6snRNP三聚体相结合，构成60s的剪接体，进展RNA前体分子的剪接。二二 RNA的剪接的剪接 原核生物的构造基因是延续编码序列，而真核生物基因

11、往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物构造基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它构造基因只需两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的构造基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后，切去内元，将有编码意义的核苷酸片段外显子衔接起来图 RNA的编辑是某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改动，由于经过编辑的mRNA的序列发生了不同于模版DNA的变化 RNA的编辑能够是充分发扬生理功能所必需的。载体蛋白mRNA中的C-U,谷氨酸受体蛋白mRNA中的A-I，都属于脱氨基作用的结果，分别由

12、胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶所催化。通常情况下，该酶促反响的特异性不强，腺嘌呤脱氨酶可以作用于双链RNA区的任何腺苷酸残基。但是，RNA的编辑发生在带有催化作用的脱氨酶亚基的复合体中，有附加的RNA结合区能协助识别所编辑的特异性靶位点。 除了RNA的编辑之外，有些RNA，特别是前体rRNA和tRNA，还能够有特异性化学修饰如下：三三 RNA的编辑和化学修饰的编辑和化学修饰蛋白质的生物合成步骤蛋白质的生物合成步骤蛋白质的合成是一个比DNA的复制和转录更为复杂的过程。它包括：(1)翻译的起始 核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合物。(2)肽链的延伸 由于核糖体沿mRNA5端向3端挪动，开场了

13、从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段。(3)肽链的终止及释放 核糖体从mRNA上解离，预备新一轮合成反响。核糖体是蛋白质合成的场所。mRNA是蛋白质合成的模板。转移RNA(transfer RNA，tRNA)是模板与氨基酸之间的接合体。第四章第四章 生物信息的传送下生物信息的传送下 在合成的各个阶段有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。参与蛋白质合成的各种组分约占细胞干重的35%。在真核生物中有将近300种生物大分子与蛋白质的生物合成有关。 蛋白质合成是一个需能反响，要有各种高能化合物的参与。细胞用来进展合成代谢的总能量的90%耗费在蛋白质合成过程中。 在真核生物细胞核内

14、合成的mRNA，要运送到细胞质，才干翻译生成蛋白质。 所谓翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开场，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原那么，依次合成一条多肽链的过程。 蛋白质合成速度很高。大肠杆菌只需求5s就能合成一条由100个氨基酸组成的多肽。蛋白质合成的生物学机制蛋白质合成的生物学机制蛋白质是生物活性物质中最重要的大分子组分，生物有机体的遗传学特性要经过蛋白质来得到表达。蛋白质的生物合成包括氨基酸活化、肽链的起始、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。1氨基酸的活化：蛋白质合成的起始需求核糖体大小亚基、起始tRNA和几十个蛋白因子。在mRNA编码区5端构成核糖体-mRNA-起

15、始tRNA复合物并将甲硫氨酸放入核糖体P位点。2翻译的起始：细菌中翻译的起始需求如下7种成分:30S小亚基，模板mRNA，fMet-tRNAfMet，3个翻译起始因子(IF-l、IF-2和IF-3)，GTP，50S大亚基，Mg2。翻译起始又可被分成3步。第一步，30S小亚基与翻译起始因子IF-l，IF-3的作用下经过mRNA 的SD序列与之相结合。第二步，在IF-2和GTP的协助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA、mRNA及3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合；然后，释放翻译起始因子。3肽链的延伸：

16、当第一个氨基酸与核糖体结合以后，按照肽链的延伸：当第一个氨基酸与核糖体结合以后，按照mRNA模板密模板密码子的陈列，氨基酸经过新生肽键的方式被有序地结合上去。码子的陈列，氨基酸经过新生肽键的方式被有序地结合上去。 每加一个每加一个AA是一个循环，每个循环包括是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键与核糖体结合、肽键的生成和移位。的生成和移位。4肽链的终止：肽链在延伸过程中，当终止密码子出如今核糖体的肽链的终止：肽链在延伸过程中，当终止密码子出如今核糖体的A位位时，没有相应的时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别终止密码子并能与之结合，而释放因子能识别终止密码子

17、并与之结合，水解与之结合，水解P位上多肽链与位上多肽链与tRNA之间的酯键。新生的肽链和之间的酯键。新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体解体，蛋白质合成终了。释放因子从核糖体上释放，核糖体解体，蛋白质合成终了。释放因子RF催化催化GTP水解促使肽链与核糖体解离。水解促使肽链与核糖体解离。5蛋白质前体的加工：新生多肽链大多数是没有功能的，必需经过加工蛋白质前体的加工：新生多肽链大多数是没有功能的，必需经过加工修饰才干转变为有活性的蛋白质。修饰才干转变为有活性的蛋白质。 1N端端fMet或或Met的切除；的切除； 2二硫二硫键的构成键的构成 二硫键是蛋白质合成后经过两个半胱氨酸的氧化作用生成

18、的。二硫键是蛋白质合成后经过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。3特定氨基酸的修饰特定氨基酸的修饰 氨基酸侧链的修饰包括磷酸化氨基酸侧链的修饰包括磷酸化(如核糖体蛋白质如核糖体蛋白质)、糖基化糖基化(如各种糖蛋白如各种糖蛋白)、甲基化、甲基化(如组蛋白、肌肉蛋白质如组蛋白、肌肉蛋白质)、乙基化、乙基化(如组如组蛋白蛋白)、羟基化、羟基化(如胶原蛋白如胶原蛋白)和竣基化等。和竣基化等。蛋白质运转机制蛋白质运转机制 蛋白质的合成位点与功能位点经常被细胞内的膜所隔开，蛋白质需求运转。核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所，任何时候都有许多蛋白质被保送到细胞质、细胞核、线粒体和内质网等各个部分，补充和更新细

19、胞功能。细胞各部分都有特定的蛋白质组分，蛋白质必需准确无误地定向运送才干保证生命活动的正常进展。 蛋白质运转可分为两大类: 1、翻译运转同步机制：蛋白质的合成和运转同时发生，那么属于; 2、翻译后运转机制：蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。 分泌蛋白质大多是以同步机制运输的。 在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。 参与生物膜构成的蛋白质，依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。1 翻译翻译-运转同步机制运转同步机制分泌蛋白的生物合成开场于核糖体，翻译到大约50个氨基酸残基，信号肽开场从核糖体的大亚基显露，被内质网膜上的受体识别并与之结合。信号肽过膜后被内质

20、网腔的信号肽酶水解，新生肽随之经过蛋白孔道穿越疏水的双层磷脂。当核糖体移到mRNA的“终止密码子，蛋白质合成即告完成，翻译体系解散，膜上的蛋白孔道消逝，核糖体重新处于自在形状。蛋白质定位的信息存在于该蛋白质本身构造中，并且经过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。信号肽紧接在起始密码之后，大部分是疏水氨基酸。信号肽的长度在1336个残基。 信号肽的特点：1、1015个疏水氨基酸；2、N端有带正电荷的氨基酸；3、C端接近切割点处代数个极性氨基酸；4、C端氨基酸侧链短。2 翻译后运转机制 叶绿体和线粒体中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供的，其中绝大多数以翻译后运转机制进入细胞器内。2.1 线粒体蛋白质跨

21、膜运转线粒体蛋白质跨膜运转特征:1、经过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体方式存在，它由成熟蛋白质和位于N端的一段前导肽(leader peptide)共同组成,前导肽约含2080个氨基酸残基，当前体蛋白过膜时，前导肽被多肽酶所水解，释放成熟蛋白质。 2、蛋白质经过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与分子伴侣相结合的待运转多肽，经过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。蛋白质跨膜运转时的能量来自线粒体Hsp70引发的ATP水解和膜电位差。2.2 前导肽的作用与性质拥有前导肽的线粒体蛋白质前体可以跨膜运转进人线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，那么失去

22、继续跨膜才干。因此，前导肽对线粒体蛋白质的识别和跨膜运转起着关键作用。前导肽具有如下特性:带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间;短少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸(特别是丝氨酸)含量较高;有构成两亲(既有亲水又有疏水部分)-螺旋构造的才干3 核定位蛋白的运转机制核定位蛋白的运转机制蛋白质普统统过核孔进入细胞核。核糖体蛋白首先在细胞质中合成，运转到细胞核内，在核仁中被装配成40S和60S核糖体亚基，然后运转回到细胞质中去合成蛋白质合成。RNA、DNA聚合酶、组蛋白、拓扑异构酶及大量转录、复制调控因子都必需从细胞质进入细胞核才干正常发扬功能。在多细

23、胞真核生物中，每当细胞发生分裂时，核膜被破坏，等到细胞分裂完成后，核膜被重新建成，分散在细胞内的核蛋白必需被重新运入核内，因此，为了核蛋白的反复定位，这些蛋白质中的信号肽被称为核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)普通都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白质向核内运输的过程蛋白质向核内运输过程需求核运转因子、和一个GTP酶(Ran)。和组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体，与核定位序列相结合的是亚基。由上述3个蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依托Ran GTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，和亚基解离，核蛋白与亚基解离，和分别经过核孔复

24、合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。4 蛋白质的降解蛋白质的降解甲基化：在核苷酸或核糖基上加一个或多个-CH3 。举例：鸟嘌呤甲基化产物MTG去氨基化：从碱基上去掉氨基。举例：鸟嘌呤去氨基后成为次黄嘌呤。硫代：用硫代取代碱基分子上的氧。举例：4-硫脲嘧啶。碱基的同分异构化：碱基环构造上发生分子替代。举例：脲嘧啶同分异构化生成假脲嘧啶。二价键的饱和化把一个二价键饱和。举例：二氢脲嘧啶。核苷酸的替代：用不常见核苷酸交换常见核苷酸，举例：荃嘧啶DNA甲基化能够存在于一切高等生物中并与基因表达调控亲密相关，DNA甲基化能封锁某些基因的活性，去甲基化那么诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起

25、染色体构造、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改动，从而控制基因表达。第六章第六章 原核基因表达调控原核基因表达调控基因表达调控主要表如今以下几个方面：基因表达调控主要表如今以下几个方面： 转录程度上的调控转录程度上的调控(transcriptional regulation)； mRNA加工成熟程度上的调控加工成熟程度上的调控(differential processing of RNA transcript)； 翻译程度上的调控翻译程度上的调控(differential translation of mRNA).原核生物中，营养情况原核生物中，营养情况(nutritio

26、nalstatus)和环境要素和环境要素(environmental factor)对基因表达起着举足轻重的影响。对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素程度在真核生物尤其是高等真核生物中，激素程度(hormone level)和发育阶段和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控是基因表达调控的最主要手段，营养和环境要素的影响力大为下降。的最主要手段，营养和环境要素的影响力大为下降。 1、真核与原核基因组构造差别真核：真核：真核基因组构造庞大真核基因组构造庞大: 如人类细胞单倍体基因组就包含如人类细胞单倍体基因组就包含3109bpDNA，约为大

27、肠杆菌总约为大肠杆菌总DNA的的800倍倍单顺反子单顺反子基因不延续性基因不延续性:断裂基因断裂基因interrupted gene、内含子、内含子(intron)、 外外显子显子(exon)非编码区较多非编码区较多 多于编码序列多于编码序列(9:1)含有大量反复序列含有大量反复序列原核：原核： 基因组很小，大多只需一条染色体基因组很小，大多只需一条染色体 构造简炼构造简炼 存在转录单元多顺反子存在转录单元多顺反子 有重叠基因有重叠基因第七章第七章 基因的表达与调控基因的表达与调控(下下) 真核生物基因调控可分为两大真核生物基因调控可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可类：第一类是瞬时调控或称可

28、逆性调控，它相当于原核生物逆性调控，它相当于原核生物细胞对环境条件所做出的反响，细胞对环境条件所做出的反响，包括某种底物或激素程度升降包括某种底物或激素程度升降时，或细胞周期不同阶段中酶时，或细胞周期不同阶段中酶活性的调理；第二类是发育调活性的调理；第二类是发育调控或称不可逆调控，使真核基控或称不可逆调控，使真核基因调控的精华部分，它决议真因调控的精华部分，它决议真核细胞生长分化发育的全部进核细胞生长分化发育的全部进程。程。二、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及二、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间构造方面存在以的空间构造方面存在以下几个方面的差别下几个方面的差别 在真核细胞中

29、，一条成熟的在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因支配子方式。原核生物中常见的多基因支配子方式。 真核细胞真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只需一小部分与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只需一小部分DNA是裸是裸露的。露的。 高等真核细胞高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。还存在不被翻译的内含子。 真核生物可以有序地根据生长发育阶段的需求进展真核生物可以有序地根据生长发育阶段的需求进展DNA片段重排，还能片段重排

30、，还能在需求时添加细胞内某些基因的拷贝数。在需求时添加细胞内某些基因的拷贝数。 在真核生物中，基因转录的调理区相对较大，它们能够远离启动子达几在真核生物中，基因转录的调理区相对较大，它们能够远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调理区普统统过改动整个所控制基因百个甚至上千个碱基对，这些调理区普统统过改动整个所控制基因5上游区上游区DNA构型来影响构型来影响RNA聚合酶与它的结合。聚合酶与它的结合。 在原核生物中，转录的调理区都很小，大都位于启动子上游不远处，在原核生物中，转录的调理区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调理位点上可直接促进或抑制调控蛋白结合到调理位点上可直接促进或

31、抑制RNA聚合酶与它的结合。聚合酶与它的结合。 真核生物的真核生物的RNA在细胞核中合成，只需经转运穿过核膜，到达细胞质后，在细胞核中合成，只需经转运穿过核膜，到达细胞质后，才干被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严厉的空间间隔。才干被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严厉的空间间隔。 许多真核生物的基因只需经过复杂的成熟和剪接过程，才干顺利地翻译许多真核生物的基因只需经过复杂的成熟和剪接过程，才干顺利地翻译成蛋白质。成蛋白质。加强子、特点、作用原理加强子、特点、作用原理加强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显添加的加强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显添加的DNADNA序列。序列。加强子特

32、点：加强子特点： 加强效应十清楚显，普通能使基因转录频率添加加强效应十清楚显，普通能使基因转录频率添加10-20010-200倍倍 加强效应与其位置和取向无关，不论加强子以什么方向陈列加强效应与其位置和取向无关，不论加强子以什么方向陈列5 533或或3 355，甚至和靶基因相距，甚至和靶基因相距3kb3kb，或在靶基因下游，或在靶基因下游，均表现出加强效应；均表现出加强效应；大多为反复序列，普通长约大多为反复序列，普通长约50bp50bp，适宜与某些蛋白因子结合。，适宜与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个中心序列：其内部常含有一个中心序列：G GTGGA/TA/TA/TTGGA/TA/TA/T

33、G G，该序，该序列是产生加强效应时所必需的；列是产生加强效应时所必需的； 加强效应有严密的组织和细胞特异性，阐明加强子只需与加强效应有严密的组织和细胞特异性，阐明加强子只需与特定的蛋白质转录因子相互作用才干发扬其功能；特定的蛋白质转录因子相互作用才干发扬其功能； 没有基因专注性，可以在不同的基因组合上表现加强效应；没有基因专注性，可以在不同的基因组合上表现加强效应； 许多加强子还受外部信号的调控，许多加强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的加强子，就可以对环境如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的加强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反响。中的锌、镉浓度做出反响。作用原理：加

34、强子能够有以下三种作用机制：作用原理：加强子能够有以下三种作用机制：影响模版附近的影响模版附近的DNA双螺旋构造，导致双螺旋构造，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介构成加强子与启动子之间与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介构成加强子与启动子之间“成成环衔接，活化基因转录；环衔接，活化基因转录；将模版固定在细胞核内特定位置，如衔接在核基质上，有利于将模版固定在细胞核内特定位置，如衔接在核基质上，有利于DNA拓扑异拓扑异构酶改动构酶改动DNA双螺旋构造的张力，促进双螺旋构造的张力，促进RNA聚合酶聚合酶在在DNA链上的链上的结合和滑动；结

35、合和滑动；加强子区可作为反式作用因子或加强子区可作为反式作用因子或RNA聚合酶聚合酶进入染色质构造的进入染色质构造的“入口入口7.4 真核基因转录调控的主要方式真核基因转录调控的主要方式细胞除经过细胞除经过DNA复制和随后的细胞分裂将本身所固有的遗传信息由亲代传复制和随后的细胞分裂将本身所固有的遗传信息由亲代传至子代，它们还不断地至子代，它们还不断地“感知环境的各种变化，并对其作出特有的感知环境的各种变化，并对其作出特有的应对。细胞应对可分为三个阶段：应对。细胞应对可分为三个阶段：外界信息的感知，既由细胞膜到细胞核内的信息传送；外界信息的感知，既由细胞膜到细胞核内的信息传送；染色质程度上的基因

36、活性调控；染色质程度上的基因活性调控；特定基因的表达。特定基因的表达。4.1 蛋白质磷酸化、信号传导及基因的表达蛋白质磷酸化、信号传导及基因的表达蛋白质磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导方式，几蛋白质磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导方式，几乎涉及一切的生理及病理过程。乎涉及一切的生理及病理过程。细胞外表受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导蛋白想象变化，细胞外表受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导蛋白想象变化，使细胞外信号顺利经过质膜进入细胞内，或是受体发生寡聚化而被使细胞外信号顺利经过质膜进入细胞内，或是受体发生寡聚化而被激活。普通情况下，受体分子活化

37、细胞功能的途径有两条：一是受激活。普通情况下，受体分子活化细胞功能的途径有两条：一是受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性，胞内信号经过酪体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性，胞内信号经过酪氨酸激酶途径得到传送；二是配体与细胞外表受体结合，经过氨酸激酶途径得到传送；二是配体与细胞外表受体结合，经过G蛋蛋白介导的效应系统产生介质，活化丝氨酸白介导的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶，苏氨酸或酪氨酸激酶，从而传送信号。从而传送信号。4.2 激素及其影响激素及其影响 许多类固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素许多类固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄

38、激素以及普通代谢性激素的调控都是经过启动基因转录而实现的。靶细以及普通代谢性激素的调控都是经过启动基因转录而实现的。靶细胞具有专注的细胞受体，可与激素构成复合物，导致三维构造甚至胞具有专注的细胞受体，可与激素构成复合物，导致三维构造甚至化学性质的变化。经修饰的受体与激素复合物经过核膜进入细胞核化学性质的变化。经修饰的受体与激素复合物经过核膜进入细胞核内，并与染色质的特定区域相结合，导致基因转录的起始或封锁内，并与染色质的特定区域相结合，导致基因转录的起始或封锁许多类固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素以许多类固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素以及普通代谢性激素的调

39、控都是经过启动基因转录而实现的。三种假及普通代谢性激素的调控都是经过启动基因转录而实现的。三种假说：受体流动假说、中介物假说、邻位互调假说。说：受体流动假说、中介物假说、邻位互调假说。热激蛋白诱导的基因表达热激蛋白诱导的基因表达1 基因工程与基因治疗的差别基因工程与基因治疗的差别基因工程是将具有运用价值的基因，即基因工程是将具有运用价值的基因，即“目的基因，装配在具有表达元件的特目的基因，装配在具有表达元件的特定载体中，导入相应的宿主如细菌、酵母或哺乳动物细胞中，在体外进展定载体中，导入相应的宿主如细菌、酵母或哺乳动物细胞中，在体外进展扩增，经分别、纯化后获得其表达的蛋白产物。基因治疗是将具有

40、治疗价扩增，经分别、纯化后获得其表达的蛋白产物。基因治疗是将具有治疗价值的基因，即值的基因，即“治疗基因装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载治疗基因装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，直接进展表达。体中，导入人体细胞，直接进展表达。可大大降低治疗本钱。由于基因治疗不需求基因工程中耗资最大的器材与资料可大大降低治疗本钱。由于基因治疗不需求基因工程中耗资最大的器材与资料费用，显著降低了工业化的本钱。费用，显著降低了工业化的本钱。基因工程的基因工程的“目的基因主要是可分泌蛋白，如生长因子、多肽类激素、细胞因目的基因主要是可分泌蛋白，如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性

41、受体等，对于非分泌性蛋白质，由于它们往往不能有效地进入子、可溶性受体等，对于非分泌性蛋白质，由于它们往往不能有效地进入细胞而不能被运用于基因工程。但基因治疗不受上述限制。几乎一切的基细胞而不能被运用于基因工程。但基因治疗不受上述限制。几乎一切的基因，只需它具有治疗作用，实际上均可运用于基因治疗。因此，基因治疗因，只需它具有治疗作用，实际上均可运用于基因治疗。因此，基因治疗具有更大的潜力。具有更大的潜力。基因工程的操作全部在体外完成，基因治疗那么必需将基因直接导入人体细胞。基因工程的操作全部在体外完成，基因治疗那么必需将基因直接导入人体细胞。这不仅在技术上具有很大的难度，而且在平安性与有效性方面

42、提出了更为这不仅在技术上具有很大的难度，而且在平安性与有效性方面提出了更为苛刻的要求。苛刻的要求。基因工程曾经有三四十年的历史，技术已比较成熟；基因治疗仅有十多年的历基因工程曾经有三四十年的历史，技术已比较成熟；基因治疗仅有十多年的历史，不少技术还不够成熟。所以，它遇到的风险更大。史，不少技术还不够成熟。所以，它遇到的风险更大。2 2 基因治疗的概念和战略基因治疗的概念和战略基因治疗基因治疗(gene therapy)(gene therapy)就是用正常或野生型就是用正常或野生型(wild type)(wild type)基因矫正或置换致病基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法

43、中，目的基因被导入到靶细胞基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞target cellstarget cells内，它们或与宿主细胞内，它们或与宿主细胞host cellhost cell染色体整合成为宿主染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。到表达，起到治疗疾病的作用。 目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸程度上开展的疾病治疗方法

44、都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深化了解程度上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深化了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的开展。根据所和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的开展。根据所采用的方法不同，基因治疗的战略大致可分为以下几种：采用的方法不同，基因治疗的战略大致可分为以下几种：基因置换基因置换gene replacementgene replacement：基因置换就是用正常的基因原位交换病变细胞：基因置换就是用正常的基因原位交换病变细胞内的致病基因，使细胞内的内的致病基因，使细胞内的DNADNA完全恢复正常形状。这种治疗方法最为理

45、想，完全恢复正常形状。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术缘由尚难到达。但目前由于技术缘由尚难到达。 基因修复基因修复gene correctiongene correction：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保管。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，而正常部分予以保管。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实际中有一定难度。操作上要求高，实际中有一定难度。 基因修饰基因修饰gene augmentationgene augmentation又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其又称基因

46、增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因依然存在于细胞内，目前基因治疗多以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因依然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检构成。表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检构成。u 基因失活gene inactivation：利用反义技术能特异地封锁基因表达

47、特性，抑制一些有害基因的表达，已到达治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封锁肿瘤细胞的耐药基因的表达，添加化疗效果。 u 免疫调理immune adjustment：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改动病人免疫形状，到达预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的程度，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，到达防治肿瘤复发的目的。 u 其它：添加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损用力。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后

48、给予病人无毒性GCV药物，由于只需含HSV-TK基因的细胞才干将CGV转化成有毒的药物。因此肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。3 3 基因治疗的根本程序基因治疗的根本程序1 1目的基因的选择和制备：目的基因的选择和制备： 可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善病可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善病症；该基因的过高表达不会对机体呵斥危害。症；该基因的过高表达不会对机体呵斥危害。 在确定欲选目的基因后，就要制备目的基因。正向表达的基因可以是在确定欲选目的基因后，就要制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNAcDNA，也可，也可是基因

49、组是基因组DNADNA片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反响片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反响(PCR)(PCR)等等新技术进展体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用新技术进展体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备人工合成的方式制备 2 2基因的转运基因的转运 目前已有多种基因转运的方式，其根本原那么是将外源基因运到细胞内。已运用目前已有多种基因转运的方式，其根本原那么是将外源基因运到细胞内。已运用的有病毒载体和非病毒载体两大类。的有病毒载体和非病毒载体两大类。 病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的

50、细胞，在细胞内不病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；易降解；RNARNA病毒能整合到染色体以及基因程度较高等。因此病毒载体是良好病毒能整合到染色体以及基因程度较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进展几步改造：的病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进展几步改造： A A：将天然的野生型：将天然的野生型RNARNA前病毒转变成前病毒转变成DNADNA载体，并插入欲转移的相

51、关外源基因。载体，并插入欲转移的相关外源基因。其根本原那么是用标志基因和外源基因替代病毒的编码基因。其根本原那么是用标志基因和外源基因替代病毒的编码基因。B B：制备辅助细：制备辅助细胞为载体胞为载体DNADNA提供其丧失的功能提供其丧失的功能 C C：将载体：将载体DNADNA导入辅助以产生病毒载体。导入辅助以产生病毒载体。 D D：病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。3靶细胞的选择 实际上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的才干，目前基因治疗中制止运用生殖细胞作为靶细胞，而只能运用体细胞，用于转基因的体细胞必需取材方便，含量丰富，容

52、易培育，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实践上运用中应详细根据目的条件选择。 4细胞转染tansfection 将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、交融法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运中有基因引见。目前较多运用的是脂质体法。 5外源基因的表达及检测 在挑选出转化分子后还需求鉴定转导细胞中外源基因的表达情况。其中包括对目的基因和标志基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者那么

53、是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达情况。 4 基因治疗的两大途径基因治疗的两大途径基因治疗的两条主要途径：即基因治疗的两条主要途径：即 ex vivo 与与 in vivo 方式方式 ex vivo 途径途径 这主要是将含外源基因的载体在体外导入人体本身或异体这主要是将含外源基因的载体在体外导入人体本身或异体细胞，这种细胞被称为细胞，这种细胞被称为“基因工程化的细胞，经体外细胞扩增后输基因工程化的细胞，经体外细胞扩增后输回人体。这种方法易于操作，不易产生副作用，平安性好。但是，这回人体。这种方法易于操作，不易产生副作用，平安性好。但是，这

54、种方法不易构成规模，而且必需有固定的临床基地。种方法不易构成规模，而且必需有固定的临床基地。In vivo 这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。这种方式非常有利于大规模工业化消费。但是，对这种方式导体内。这种方式非常有利于大规模工业化消费。但是，对这种方式导入的治疗基因以及其载体必需证明其平安性，而且导入人体之后必需入的治疗基因以及其载体必需证明其平安性，而且导入人体之后必需能进入靶细胞，有效的表达并到达治疗的目的。因此，在技术上要求能进入靶细胞，有效的表达并到达治疗的目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于

55、上一种方式。很高，其难度明显高于上一种方式。用于基因治疗的病毒载体应具备以下根本条件：用于基因治疗的病毒载体应具备以下根本条件：携带外源基因并能装配成病毒颗粒；携带外源基因并能装配成病毒颗粒；介导外源基因的转移和表达；介导外源基因的转移和表达；对机体没有致病力。对机体没有致病力。 由于大多数野生型病毒对机体都具有致病性，需求对其由于大多数野生型病毒对机体都具有致病性，需求对其进展改造后才干被用于人体。到目前为止，只需少数几进展改造后才干被用于人体。到目前为止，只需少数几种病毒如反转录病毒、腺病毒及腺病毒伴随病毒、疱疹种病毒如反转录病毒、腺病毒及腺病毒伴随病毒、疱疹病毒等被胜利的改呵斥为基因转移载体。病毒等被胜利的改呵斥为基因转移载体。基因治疗中的问题基因治疗中的问题1 靶向性基因导入系统靶向性基因导入系统 基因治疗中的关键问题基因治疗中的关键问题是必需将治疗基因送入特定的靶细胞，并在该是必需将治疗基因送入特定的靶细胞，并在该细胞中得到高效的表达。细胞中得到高效的表达。2 外源基因表达的可控性外源基因表达的可控性 假设基因导入后表达假设基因导入后表达处于无调控的形状，将会呵斥严重的后果。最处于无调控的形状，将会呵斥严重的后果。最理想的可控性是模拟人体基因本身的调控方式。理想的可控性是模拟人体基因本身的调控方式。这将是今后长期的追求目的。这将是今后长期的追求