油橄榄抗寒性与抗旱性评价规范（征求

1、XX/T XXXXXXXXXICSB61甘肃省地方标准备案号： 62 油橄榄抗寒性与抗旱性评价规范（征求意见稿） 目 次前言II油橄榄抗寒性与抗旱性评价规范11 范围12 规范性引用文件13 术语和定义13.1 抗寒性13.2 抗旱性13.3 低温半致死温度13.4 自由水13.5 束缚水14 油橄榄抗寒性评价方法14.1 枝条采集14.2 材料处理24.3 抗寒相关指标的测定24.4 抗寒性综合评价24.5 油橄榄抗寒性分级标准35 油橄榄抗旱性评价方法35.1 试验设计35.2 样品采集35.3 抗旱相关指标的测定45.4 抗旱性综合评价45.5 油橄榄抗旱性分级标准4附录A （规范性）

2、油橄榄枝条抗寒性及抗旱性生理指标测定方法5I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由甘肃省林业和草原局提出、归口并监督实施。本文件起草单位：甘肃省林业科学研究院、陇南市武都区油橄榄研究开发中心本文件主要起草人：金高明、谢新平、张荣、王鹏、赵梦炯、戚建莉、姜成英、吴文俊、陈炜青、魏恩东、刘在国。II油橄榄抗寒性与抗旱性评价规范1 范围本文件规定了油橄榄抗寒性与抗旱性评价方法、评价指标及分级标准。本文件适用于甘肃省陇南市油橄榄产区及其他同类油橄榄产区。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条

3、款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB62/T 4026-2019 白菜型冬油菜抗寒性鉴定技术规范 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 抗寒性抗寒性是植物为了抵御和适应低温胁迫经过漫长的时间而形成的一种可遗传特性，这种特性由于果树的品种、组织结构的不同而具有明显的差异。3.2 抗旱性抗旱性是指干旱屏蔽和耐旱两方面。高等植物主要通过干旱屏蔽（drought avoidance）方式抵抗水分胁迫，某些植物在干旱条件下出现叶子卷曲，以减少水分丢失。3.3 低温半致死温度指在该温度时，植物

4、达到半致死状态。3.4 自由水在细胞内、细胞之间、生物体内可以自由流动的水。3.5 束缚水细胞中被蛋白质等亲水性的生物大分子组成的胶体颗粒或渗透性物质吸附不能自由移动的水。4 油橄榄抗寒性评价方法4.1 枝条采集采集露地栽培的长势良好、无病虫害，且树龄一致的枝条，长度约10cm，按不同种质分别装入自封袋中，带回实验室，置于5条件下贮藏备用。摘取油橄榄植株中部且大小一致的叶片，将供试叶片用蒸馏水冲洗干净，然后用滤纸将叶片上的水分吸干。每个油橄榄品种称取鲜样3份，每份0.2g，将同一条件处理的各品种叶片用干净锡纸包好，放入自封袋中，置于超低温冰箱中。4.2 材料处理采用-40低温冰箱对枝条进行低温

5、处理，设5、0、-5、-10、-15、-20，共6个梯度，升温和降温幅度为 4.0/h5.0/h，达到设定温度保持12h，之后逐步升温至5放置8h，然后进行相关指标的测定。每个处理重复3次，每次重复随机抽取8个10个枝段。4.3 抗寒相关指标的测定4.3.1 相对电导率测定及低温半致死温度的计算应按DB62/T 4026-2019的方法。4.3.2 丙二醛（MDA）含量测定应符合附录A.1的规定。4.3.3 游离脯氨酸含量测定应符合附录A.2的规定。 4.3.4 可溶性糖含量测定应符合附录A.3的规定。4.3.5 枝条水分含量测定应附合附录A.4的规定。4.3.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性

6、的测定应符合附录A.5的规定。4.3.7 过氧化氢酶(CAT)活性的测定应符合附录A.6的规定。4.3.8 过氧化物酶(POD)活性的测定应符合附录A.7的规定。4.3.9 叶绿素含量的测定应符合附录A.8的规定。4.4 抗寒性综合评价根据测得的半致死温度，丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖和水分含量，利用隶属函数法进行综合性分析。抗寒性综合评价隶属函数公式为：Uij=Xij-XjminXjmax-Xjmin()式中：Uij 表示i 种类j 指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i 种类j 指标的测定值；Xjmin表示所有种类j 指标的最小值；Xjmax表示所有种类j 指标的最大值；i 表示某个品种；j

7、表示某指标。Uij=1-Xij-XjminXjmax-Xjmin()式中：Uij 表示i 种类j 指标的抗寒隶属函数值；Xij 表示i 种类j 指标的测定值；Xjmin 表示所有种类j 指标的最小值；Xjmax 表示所有种类j 指标的最大值；i 表示某个品种；j 表示某指标。(1)和(2)分别表示正相关和负相关。4.5 油橄榄抗寒性分级标准按照平均隶属度将抗寒性分为5级，具体见表1。表1 油橄榄抗寒性分级标准品种平均隶属度分级类型油橄榄0.70 1.00高抗寒0.60 0.69抗寒0.40 0.59中抗寒0.30 0.39低抗寒0.00 0.29不抗寒5 油橄榄抗旱性评价方法5.1 试验设计设

8、置4个处理组：CK（土壤相对含水量 55%-60%）、轻度胁迫（土壤相对含水量 20%-25%）、中度胁迫（土壤相对含水量15%-20%）、重度胁迫（土壤相对含水量10%-15%）。采用电子称称重法控制土壤含水量，于每天下午18:00称盆栽苗的质量，及时补充缺失水分使各处理达到相应的控水程度。水分胁迫处理20天后，开始测定与抗旱性相关的生理生化指标，各指标平行测定三次，取平均值。5.2 样品采集摘取油橄榄植株中部且大小一致的叶片，将供试叶片用蒸馏水冲洗干净，然后用滤纸将叶片上的水分吸干。每个油橄榄品种称取鲜样3份，每份0.2g，将同一条件处理的各品种叶片用干净锡纸包好，放入自封袋中，置于超低温

9、冰箱中。5.3 抗旱相关指标的测定5.3.1 丙二醛（MDA）含量测定应符合附录A.1的规定。5.3.2 游离脯氨酸含量测定应符合附录A.2的规定。5.3.3 可溶性糖含量测定应符合附录A.3的规定。5.3.4 枝条水分含量测定应附合附录A.4的规定。5.3.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定应符合附录A.5的规定。5.3.6 过氧化氢酶(CAT)活性的测定应符合附录A.6的规定。5.3.7 过氧化物酶(POD)活性的测定应符合附录A.7的规定。5.3.8 叶绿素含量的测定应符合附录A.8的规定。5.4 抗旱性综合评价参考4.45.5 油橄榄抗旱性分级标准按照平均隶属度将抗旱性分为5级，具

10、体见表2。表2 油橄榄抗旱性分级标准品种平均隶属度分级类型油橄榄0.70 0.80高抗旱0.50 0.69抗旱0.40 0.49中抗旱0.20 0.39低抗旱0.00 0.19不抗旱7XX/T XXXXXXXXXA附录A （规范性）油橄榄枝条抗寒性及抗旱性生理指标测定方法A.1 丙二醛（MDA）含量测定方法采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量。取低温处理后枝条，去除表皮，避开芽眼，剪碎，混匀后，每次称取 0.2 g，每个品种重复 3 次。加入低温处理并剪碎的枝段、1 g石英砂和10% 三氯乙酸（TCA）2 ml 在冰浴研钵中，研磨成匀浆，再加 3 ml l0% 的TCA一同转入离心管中，

11、在 4000 rpm 下离心 10 min，取上清液 2 ml（对照加 2 ml蒸馏水），加入 2 ml 0.6% TBA摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸 10 min（自试管中溶液出现小气泡开始计时），取出试管以冷水浴迅速将试管内溶液冷却，在 3000 rpm 下离心 10 min，使用分光光度计分别测定上清液在 450 nm、532 nm和600 nm 波长的光度值（对照为 2 ml 0.6% TBA 溶液加 2 ml 蒸馏水），依据以下公式计算MDA的含量（mol/g FW-1）。MDAmolgFW-1=6.45×A532-A600-0.56×A450×V1(V

12、2×FW)(A.1)式中：V1 为提取液总体（ml）；FW 为样品鲜重（g）；V2 为测定用提取液体积（ml）。A.2 游离脯氨酸含量测定方法采用茚三酮比色法测定。加入低温处理并剪碎的枝段和3%磺基水杨酸溶液 5 ml 于具塞试管中，在沸水浴中封口显色提取 10 min，冷却后取滤液 2 ml，加入 2 ml 冰醋酸和 2 mL 酸性茚三酮显色液，水浴中煮沸显色 30 min，冷却后加入 5 ml 甲苯萃取红色物质，待完全分层后，取上层红色甲苯溶液，测定 520 nm 波长的吸光值（以甲苯为对照）。并根据标准曲线和公式计算出脯氨酸含量（g/g）。脯氨酸含量(gg)=(C×V

13、A)/FW(A.2)式中：C 为由标准曲线上查得的游离脯氨酸的含量（g）；V 为提取液总体积（ml）；A 为测定时加样量（ml）；FW 为样品重（g）A.3 可溶性糖含量测定方法可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法。加入低温处理并剪碎的枝段和蒸馏水 10 ml于具塞试管中，封口后沸水浴 30 min，取出冷却，过滤转入 100 ml 容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗残渣后定容至刻度，再取 1 ml 稀释至 5 mL。在另一试管中加入待测液 1 ml 和蒽酮试剂4 ml，沸水浴中显色 10 min，取出冷却，并测定 620 nm 波长的吸光度（4 ml 蒽酮试剂加 l ml蒸馏水作对照）。依据标准曲线和公

14、式计算可溶性糖含量（%）。可溶性糖含量%=(C×V1)(FW×106)×100%(A.3)式中：C 为由标准曲线上查得的可溶性糖含量（g）；V1 为提取液总体积（ml）；FW 为样品重（mg）A.4 枝条水分含量测定方法A.4.1 总含水量测定迅速称取低温处理并剪碎混匀的枝条薄片1 g置于称量瓶中（提前记录称量瓶重量m0），称量此时称量瓶的重量记为m1，再将容量瓶放进烘箱，106 下烘20 min，然后在85 下烘干至称量瓶质量不再发生变化。取出冷却至室温后测定称量瓶质量记为m2，按下式计算枝条中水分含量（3次重复）：植物总含水量%=（m1-m2）（m1-m0）(

15、B.1)A.4.2 自由水的测定迅速称取剪碎混匀的枝条薄片1 g置于称量瓶中（提前记录称量瓶重量），记录称量瓶和样品的重量，然后在称量瓶中加入质量分数为60 65分析纯蔗糖溶液3 ml 4 ml，蔗糖溶液完全浸没样品为准，准确称量此时称量瓶的重量。将称量瓶在室温下放置6 h，期间进行遮光并轻轻晃动。6 h后先测定并记录原来的糖液浓度，并测定浸泡过样品后的蔗糖浓度，按照下式计算出枝条中自由水和束缚水的含量。自由水含量=糖液重×糖液原浓度-浸枝后糖液的浓度浸枝后的糖液浓度枝条鲜重×100%(B.2)束缚水含量=组织总含水量-自含量由水(B.3)在测定枝条不同含水量时，为了提高测

16、量的精确度，在剪碎和称重时应迅速，称量瓶盖子必须密封。A.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定取准备好的油橄榄碎叶片0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液，冰浴下研磨至匀浆，加缓冲液使最终体积定容为5ml。取2ml溶液于1000rpm转速下离心20min，上清液即为SOD粗提液。使用氮蓝四唑（NBT）法进行显色反应，至反应结束后，以不照光的对照做空白，于波长560nm处分别测定各样品的吸光度，求出SOD活性。SOD总活性=(A0-AS)×Vt/(0.5A0×W×V1)(A.7)式中：SOD总活性为1个酶活性单位/克(U/g)；A0为照光对照管的光吸收值

17、；AS为样品管的光吸收值；Vt为样液总体积(ml)；V1 为测定时的样品用量(ml)；W 为样品重量(g)A.6 过氧化氢酶(CAT)活性的测定使用2.8ml CAT反应液加上0.1ml酶提取液，在240nm波长下比色，以240nm每分钟光吸收值减少 0.01 为一个酶活性单位。CAT反应液：0.30ml 30%的H2O2，1.0ml的水，1.5ml的0.2 mol/L且pH为7.8的磷酸缓冲液。CAT活性u/(g·min) FW=(A240×Vt)/(W×V)式中：A240为反应时间内吸光度数值的变化；V为测定时的酶液体积(ml)；Vt为酶液总体积(ml)；W

18、为叶片鲜重(g)。A.7 过氧化物酶(POD)活性的测定称取0.3g洗净并剪碎的油橄榄叶片，冰浴条件下加入磷酸缓冲液研磨至匀浆，在5000rpm转速下离心10 min，将上清液移入10ml容量瓶中，将残渣用5ml磷酸缓冲液再提取一次，上清液为粗酶液，放入容量瓶定容存放于低温下备用。在光径1cm比色杯中加入反应混合液3ml和磷酸缓冲液1ml，作为对照，另1只中加入反应混合液3ml和上述酶液1ml，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔1min读数一次，根据吸光度来计算酶活性。POD活性u/(g·min)=(A470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)式中：A470为反应时间内吸光度数值的变化；Vs为测定时所用酶液体积；t为反应时间；Vt为提取酶液的总体积；W为样品重量（g）。A.8 过叶绿素含量的测定取新鲜油橄榄叶片，擦净表面尘土，去中脉剪碎。称取0.2g碎片，加少量石