如何理解测序蜂图

1、测序峰图测序方法现代DNA序列测序可分为一二三代。一代测序第一代测序技术包括链终止法和化学降解法，其主要特点是以待测DNA为模板，根据碱基互补规则采用DNA聚合酶体外合成新链。由于新链中渗入了带有标记的碱基类似物，可用于制备末端带有标记的DNA单链。这些末端带有标记的DNA单链是一个群体，在凝胶电泳时可以形成彼此仅差一个碱基的梯形条带。根据末端碱基的特有标记可以读取待测DNA的序列组成。链终止法（Sanger法）反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有：1 .待测的DNA单链片段，作为模板；2 .DNA聚合酶；3 .序列已知且与模板3'端互补的引物；4 .四种脱氧核甘三磷酸（dATP

2、、dGTRdCTP和dTTP）;5 .四种双脱氧核甘酸中的一种，作为DNA链合成的末端终止剂。在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核甘酸只能同新生链3端的-OH连接，而2'3-双脱氧核甘三磷酸核糖基的2'3位-OH的氧已脱掉，失去了和后来的核甘酸连接的可能性，这时碱基的掺入就有两种可能性：1. dNTP掺入新生链，使链继续延伸。2. 2'3'-ddNTP掺入，使新生链的合成终止。由于两者掺入的几率不同，就形成一套长度不一的DNA片段。最后通过A、T、G和C四Isrictace-WCTGCCAGA-叫AIGAt崂I.35JN8TAC80TuM4Product

3、sufRTreiacton的内TACTATGCCAGA臣凯ATGA033ATGATftCQGTp组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核甘酸序列。巧gimofthetourre箕l"伯Tube1PmuctsMreecioiiTemdsfe：-TACWGCXAGA-冈Q画(271Tube2Productscrra3cttonTcrrXXiWTACTATCGCGA(24)ATg>ATGA1AU©(3G)ATGMAOJ©要求测序日t使用的DNA聚合酶不能有5'-3外切酶活性（可将新合成DNA链的5'-末端除去核甘酸而改变链的长度）

4、、3'-5'外切酶活性（可将错配的碱基除去，再补上正确配对的核甘酸）。这两种活性会产生干扰条带。DNA聚合曲合成“NA引物I门4聚合髀s，T，5强机DNA5、3外切核隘防活性使DMA聚合懵可切除已存在的5'小铺3*5即核酸胞活性可使DNA聚合常校正3'错配的核讦酸I-.-馅配的犊背翟iv安光染料标记物在Sanger法中的应用目前已发现具有不同荧光色彩的标记化合物，可将其分别与指定的ddNTP结合，如ddATP标记绿色荧光，ddCTP蓝色荧光，ddTTP红色荧光，ddGTP黑色荧光。这四种标记的ddNTP混合加入到一个反应中，聚合链终止反应完成后，可以获得末端分别

5、带有A、CT和G的DNA单链。毛细管电泳带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其分配系数不同进行高效、快速分离的电泳技术。样品在电解液由冰动，根据物质的荷/质比差异来进行分离，比值愈大，跑得愈快lb)Elactrophonjeis:ACACCGTATCAT测序峰图峰图是以4种颜色连续的峰型图代表A、T、G、C4种碱基序列的图。峰的高低说明了信号的强弱，宽窄表示的是分离效果，可以对比板胶电泳的亮度和条带的宽窄。重叠则说明了样品中有长度相同但是序列不同的片段。420430«5。，汕仆。GCAGGTTGTTTChTTCAi二信石丁ACGTGGG匚匚AGAGCftftAGGTAGG丁匚GA概

6、念:读长：序列读取的碱基长度，峰图上方横向显示的数字。信号：测序序列是通过对不同碱基所携带的不同颜色的荧光信号翻译所得，荧光信号的强弱是我们常说的信号。成功峰图？峰型：尖锐、对称、无底峰;读长：800bp可信；信号：正常（1k20k）,走势平缓下降。测序峰图中可能存在的问题vi峰型问题双峰夹峰非单克隆杂合模板量高引物移码结合问题可信读长问题起始序列不准引物峰引物二聚体峰信号问题宽峰胶有气泡模板不纯特定位置序列不准底峰不干净模板不纯信号弱衰减或中断弱或无模板和引物结合较弱模板和引物不结合双峰非单克隆特征：从插入位点开始双峰或某个位置开始双峰处理方法：重新挑单克隆测序20例汕SOM8090TiCG

7、jTTCGiGCTCGGTACCCGGJlTCETCT£GG二丁TiTTTCi；Cii.匚GGGiCCiGCGCTTGCGGCTTGTGICCiTC杂合（突变）特征：峰图中某些位置双峰12013。1401501&017(11初CTGTTCaCCAiTTTTiCTIG*匚丁盘ACTGCAGTG4TTGA&CTTGGiTTiftTIAACAiG4ACA*TAFigure1SNP70fllD90100110120190GATAT£HGChGAATTCGC£CTTGTTTA&GGCCTAGCTAGCAGAATCCCTTGTTACTIACC1AlCF

8、igure2杂合缺失特征：从碱基缺失位置出现移码。移码底峰序列表现为主峰向左或向右移动后的序时7o加90loonouino1T*TGGCGACiGCTTCATGCC4GTCTAAA*TCfcCiTTTATCGiTGCTGAC*iAGCTATTTTATTiCACCGCGCTTACCCCATTTTT'jGG.rTT7.'.TCTCTTTCT7AT7L"ATC'.：.r.'.,I.'.TTG；C.,.7TC；.：.TCG,-.T：-.S.：.T?!.：.：.7/.TGT'T.CT：.TTT"T.ATJI07：.T7-IlIII结合问

9、题（JH）45C4fin加口5cm510=30引物问题（YM）:引物合成不纯或降解特征：序列一开始就出现移码现象处理方法：重新合成引物再测序特征：（1）一开始就是双峰，在某一点终止或从头到尾双峰可能原因：模板上有2个或2个以上以上引物结合位点、模板或引物不纯处理方法：重新制备样品或设计特异引物测序JHD-h二门''I1Ga:工AU二行r*TTCtrOgCHOCG>.rcGC1-T二Tr匚仁-TGi-13叱J.：72Dm?<gg_3«，匚CT哈丁亡仃,口JCAGIOCOT<2GA-i：GC丁，电*白夹峰：模板量高特征：峰图中两峰之间夹有小杂峰，一般不影

10、响主峰的读取，在信号图中表现为反应信号过高。处理方法：直接或稀释重跑，降低模板量测序130L0口J170JGATTC.i：CTTCGCCiTCGCTCTTCCTCCCCATATCTCGCATTTCACTGCTA|hjbaa?r3«hiia.q*plmfm*ipauqamn事二胃口串”事卜¥日；lvbi-aa»iriramd!«x-aqMbk?MLrada8hm*H>IHf2fV3H-IIJVE”3WVhsvlrFl，的！mraKM由事i宽峰可能原因：模板不纯或POP7胶中有气泡处理方法：重跑4时49LS0(S1052D53(540550lTCGCC

11、AASACCACGTTTTCGiGCTZGGCGAGCTC2GiA4TTITCiGCGGTGGTCCGGTGGC(；CTCACGGiAAiTTTfln底峰不干净特征：信号图中基线不齐或信号弱可能原因：模板纯度不好，有杂质；模板量偏低或反应进行不充分处理办法：重新纯化或重送样；加量重做或重送样MHII»用IK|AhATCACC<JiCA1C<-hi.t£rTA：iQA.k白4ttLtLJi*E匕iTC1LA11dF：kTCC：CG.1t,dIth*1引物峰及引物二聚体峰特征：在20-30、40-60bp碱基处有高信号的峰形成，之后信号可能衰减。处理方法：重新合成引

12、物或重新设计引物测序。引物形成二聚体致使反应无信号7r-trfT"3博二。"&TCK,"ril*-!<-96*rwb!191-g4Cfci>nU4>tw-=不干扰峰（染料峰）和酒精峰特征：4个干扰峰固定出现在30、40、70、110bp附近处理方法：重新测序条料上轮住于k10G石展基工内,图十普求才台品酉才肯住住于200300将爱在之I旬,"透明白勺降解峰特征：在220、450bp附近G碱基降解，峰型扩散。处理方法：若不影响碱基判读不安排调整，否则安排重新测序?&0ArGTuaCGT7B7BOqHWTGTTTGTGTAT

13、TTGTG重复序列（CF）特征：单碱基或两个以上碱基重复出现，导致后续峰图可能移码或乱峰。处理方法：因重复未测到的序列，建议加测反向补拼理余的A】OrCJT4个HigDyc'1I1J.UJLULJUl'aUJ.taUIA1CC&GTGdOGI&GGCGGGGeLCCGGGGCGCTT&TGGOGTGiTCGGGGGGGGGGTTT270<260W903QQ310rTaTTattatTattattaTtattattattatTattattattat局GC(GC)特征：序列局部碱基GC富集，之后可能信号衰减，峰图变乱。苧/叫iuv，土U1UIbiIbUTGCTGTGCCGCtCGCCGTCGCGGTGGCGCtCCTCGCGCifCGGCTTCGTGTCCICGGG£GCGTTtGGCGCGGCGC回文结构及其他结构（J0特征：信号衰减或中断，峰图变乱。处理方法：最好选用GC优化程序无信号特征：峰图表现为杂乱无章形成原因：引物和模板不能正常结合反应，包括漏加，力口错，有影响结合或影响反应因处理方法：菌液用通用引物测无信号的安排重新摇菌、自带引物无信号建议通用引物测序；质粒、pcr测序无信号的不调整，建议客户重新送样，若失败较多的挑几个重测，并跟客户说明情况»J1010