第二章 微生物发酵产酶

1、第二章 微生物发酵产酶第1页，共101页。Contents of chapter 21、酶生物合成过程2、常见产酶微生物3、酶的发酵工艺条件及控制4、酶生产过程的动力学GoGoGoGo第2页，共101页。酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGluc

2、oamylase from AspergillusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew example第3页，共101页。微生物发酵产酶n酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。n大多数酶的生产采用发酵生产原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点第4页，共101页。微生物发酵产酶n优良的产酶微生物具备的条件：优良的产酶微生物具备的条件：n（1）酶的产量高；n（2）产酶稳定性好；n（3）容易培养和管理；n（4）利于酶的分离纯化；n（5）安全可靠、无毒性等。第5页，共101页。微生物发酵产酶

3、n酶的发酵生产的方式：酶的发酵生产的方式：n固体培养发酵n液体深层发酵n固定化微生物细胞发酵n固定化微生物原生质体发酵第6页，共101页。微生物发酵产酶n酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论n蛋白类酶和核酸类酶酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程.n合成过程:n酶的基因（DNA）（转录）RNA （翻译）多肽链（加工、组装）蛋白质第7页，共101页。酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme1、中心法则- Central Dogma 2、RNA的生物合成- Transcription3、蛋白质的生物合成- Translation4、酶生

4、物合成的调节- RegulationGoGoGoGo第8页，共101页。Reverse transcription1、中心法则-Central Dogma 第9页，共101页。2、RNA的生物合成(转录)- Transcription细胞内RNA的生物功能 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。第10页，共101页。3、蛋白质的合成(翻译)-Tra

5、nslation翻译翻译: : 以以RNARNA中中mRNAmRNA为模板为模板, ,按照其按照其 核苷酸顺序所组成的密码指核苷酸顺序所组成的密码指 导蛋白质的合成的过程导蛋白质的合成的过程. .mRNAmRNA蛋白质蛋白质翻译翻译 各种信息各种信息 各种蛋白质各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）第11页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节机制n原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节n雅各（雅各（Jacob）和莫诺德（）和莫诺

6、德（Monod）于）于1960年提出年提出的操纵子学说（的操纵子学说（Operon theory）来阐明的。）来阐明的。第12页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节机制n操纵子学说概述操纵子学说概述n操纵子（操纵子（OperonOperon）：是基因表达和控制的一个完整单）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操纵基因和启动元，其中包括结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因。基因。第13页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节机制n操纵子

7、学说概述操纵子学说概述n启动基因（启动基因（Promoter genePromoter gene）：由两个位点组成，一个）：由两个位点组成，一个是是RNARNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cyclic cyclic AMP, cAMPAMP, cAMP）与）与CAPCAP组成的复合物组成的复合物 ( cAMP-CAP) ( cAMP-CAP) 的结合的结合位点。位点。n操纵基因（操纵基因（Operator geneOperator gene）：与调节基因产生的变构）：与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生蛋白（阻遏蛋白）中

8、的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。物合成的时机和合成速度。第14页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节机制n操纵子学说概述操纵子学说概述n调节基因（调节基因（Regulator geneRegulator gene）: : 产生一种阻遏蛋白。产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。结合而改变其结构，从而

9、改变它与操纵基因的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，RNARNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进行结构基因的位置进行转录，酶的生物合成也就无进行结构基因的位置进行转录，酶的生物合成也就无法进行。法进行。第15页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节机制n操纵子学说概述操纵子学说概述n结构基因（结构基因（Strutural geneStrutural gene）：结构基因与多肽链有）：结构基因与多肽链有各自的对应

10、关系。结构基因上的遗传信息可以转录成各自的对应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为为mRNAmRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条多肽链。每一个结构基因对应一条多肽链。第16页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节机制n操纵子学说概述操纵子学说概述n诱导型操纵子（诱导型操纵子（Inducible operonInducible operon）大肠杆菌乳糖大肠杆菌乳糖操纵子操纵子第17页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n原核生物中酶生物合成

11、的调节机制原核生物中酶生物合成的调节机制n操纵子学说概述操纵子学说概述n阻遏型操纵子（阻遏型操纵子（Repressible operonRepressible operon）色氨酸操纵子色氨酸操纵子 ( Trp operon )( Trp operon )n色氨酸操纵子色氨酸操纵子(tryptophane operon)(tryptophane operon)负责色氨酸的生负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trptrp基因表基因表达，色氨酸或与其代谢有

12、关的某种物质在阻遏过程达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。（而不是诱导过程）中起作用。 第18页，共101页。第19页，共101页。酶生物合成的调节酶生物合成的调节n真核生物酶生物合成的调节真核生物酶生物合成的调节n目前为止，还没有统一的理论和模型来阐述真核生物酶生物合成的调节规律。第20页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production基本要求：n不是致病菌n发酵周期短,产酶量高n不易变异退化n最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。n对医药和食品用酶,还应考虑安全性：n凡从可食部分或食品加工中传统

13、使用的微生物生产的酶,安全!n由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。n非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。第21页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn1、细菌n细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。第22页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn1、细菌n细菌属于真细菌纲细菌属于真细菌纲( (SchizomycetesSchizomycetes) )，是单细胞，横

14、分，是单细胞，横分裂或二分裂繁殖，依细胞的形状和分裂后的集合状态裂或二分裂繁殖，依细胞的形状和分裂后的集合状态而给予各种名称。按形状分为球菌、杆菌、螺旋菌等。而给予各种名称。按形状分为球菌、杆菌、螺旋菌等。球菌又有单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌又有单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。球菌、葡萄球菌等。 第23页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production 球菌球菌 链球菌链球菌第24页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production

15、 四联球菌四联球菌 葡萄球菌葡萄球菌第25页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production 杆菌杆菌 螺旋菌螺旋菌第26页，共101页。n形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。nEscherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。n大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。n应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌

16、基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等第27页，共101页。n菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。n应用：有机酸(食醋等）、葡葡萄糖异构酶萄糖异构酶( (高果糖浆高果糖浆 ) )、山梨糖 (维C中间体） 第28页，共101页。n直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。n枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。第29页，共101页。常用

17、的产酶微生物常用的产酶微生物n放线菌放线菌(actinomycetes) n放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌(Streptomyces)。n链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，菌丝直径0.21.2m。革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。n链霉菌是生产葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16羟化酶，可用于甾体转化。第30页，共101页。常用的产酶微生物常用的产酶微生物n放线菌放线菌n链霉菌属 n诺卡氏

18、菌属第31页，共101页。常用的产酶微生物常用的产酶微生物n放线菌放线菌 n诺卡氏菌属n多为需氧型腐生菌，少数厌氧型寄生菌。已报道有100余种，主要分布于土壤。许多种能产生抗生素，如利福霉素（rifomycin）等，有的用于石油脱蜡，烃类发酵 及 污 水 处 理 等 。第32页，共101页。常用的产酶微生物常用的产酶微生物n放线菌放线菌n链霉菌属n主要分布于含水量较低，有机质丰富的中性或微碱性土壤中，多数为腐生，好氧菌。已知放线菌所产抗生素的90由本属产生。第33页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn2、霉菌n霉菌是

19、一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。第34页，共101页。n分类：多数属于子囊菌亚门，少分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。数属于半知菌亚门。n分布：广泛分布于土壤、空气和分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。性的黄曲霉毒素。n代表种：代表种：黑曲霉黑曲霉Asp. NigerAsp. Niger、黄曲、黄曲霉霉Asp.flavusAsp.flavusn应用：应用：是制酱、酿酒、制醋的主要是制酱、酿酒、制醋的主要菌

20、种。是生产酶制剂（蛋白酶、菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。菌种。回本节第35页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn黑曲霉n黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成， 菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。n黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如， 糖化酶，-淀粉酶, 酸性蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，

21、过氧化氢酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶，核苷酶等。第36页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production第37页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn 米曲霉(Aspergillus oryzae)n米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生孢子头呈放射形，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达2 mm 左右，粗糙。n米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在

22、我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P等。第38页，共101页。第39页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn红曲霉（Monascus）n红曲霉菌落初期白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。通常形成红色色素。菌丝具有隔膜，多核，分枝甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或成链，闭囊壳球形，有柄，其内散生十多个子囊，子囊球形，内含8个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子则留在闭囊壳内。n红曲霉可用于生产-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。第40页，

23、共101页。第41页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn青霉(Penicillium)n青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙，顶端形成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。n青霉菌种类很多，其中产黄青霉（Penicillium chrysogenum ）用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素）果胶酶、纤维素酶等。

24、桔青霉（Penicillium cityrinum）用于生产5-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。 第42页，共101页。第43页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn木霉(Trichoderma)n木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速，呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝上可继续分枝，形成二级分枝、三级分枝，分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形

25、、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。n木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有C1酶、Cx酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的17 -羟化酶，常用于甾体转化。第44页，共101页。第45页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn 根霉(Rhizopus)n根霉生长时,由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊包子。孢子呈球形、卵形或不规则形状。根霉可用于生产糖化酶、-淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、

26、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的11-羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。第46页，共101页。第47页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn毛霉(Mucor)n毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗，一般单生，分枝较少或不分枝。孢子囊梗顶端都有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常有针状的草酸钙结晶。n毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。 第48页，共101页。第49页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme

27、 Productionn酵母酵母酵母是一群属于真菌的单细酵母是一群属于真菌的单细胞微生物。它分为两大类胞微生物。它分为两大类: : 一类能产生子囊孢子，称为一类能产生子囊孢子，称为真酵母；另一类不能生成子真酵母；另一类不能生成子囊孢子，称为类酵母。通常囊孢子，称为类酵母。通常以出芽方式进行无性繁殖，以出芽方式进行无性繁殖，也有少数酵母进行有性繁殖。也有少数酵母进行有性繁殖。细胞形状因菌株而异，有球细胞形状因菌株而异，有球形、卵园形、柠檬形、梨形、形、卵园形、柠檬形、梨形、腊肠形、也有丝状。大小一腊肠形、也有丝状。大小一般为般为1 130m30m。 第50页，共101页。常见产酶微生物 Comm

28、on microorganism in Enzyme Productionn酵母酵母n啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)n啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有14个圆形光亮的子囊孢子。n啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。第51页，共101页。第52页，共101页。常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn酵母酵母n假丝酵母假丝酵母(

29、 (CandidaCandida) )n假丝酵母的细胞圆形，卵形或长形。无性繁殖假丝酵母的细胞圆形，卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，也有真菌丝，可生为多边芽殖，形成假菌丝，也有真菌丝，可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。白色或奶油色。n假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强的素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强的17-17-羟基化酶，可以用于甾体转化。羟基化酶，可以用于

30、甾体转化。第53页，共101页。第54页，共101页。发酵工艺条件及其控制发酵工艺条件及其控制 n微生物发酵产酶的一般工艺流程微生物发酵产酶的一般工艺流程 细胞扩大培养养保藏细胞细胞活化发酵 分离纯化酶固定化细胞原生质体 固定化原生质体培养基预培养无菌空气第55页，共101页。2.3 酶的发酵工艺条件与控制 The fermentation principles and its control of enzyme production1、培养基2、发酵条件及控制3、提高产酶的措施GoGoGo下一节下一节本章目录第56页，共101页。五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水五大要素：碳源、氮源

31、、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（培养基（mediummedium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。产物的营养基质。第57页，共101页。构成细胞物质或代谢产物中碳架构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物解物水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）水是微生

32、物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水水碳源碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制第58页，共101页。构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活

33、性维持细胞结构的稳定性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、磷酸常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。等元素的化合物。 氮源氮源无机盐无机盐需要注意合适的碳氮比需要注意合适的碳氮比第59页，共101页。生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。必须另外加入少量的生长需求的有

34、机物质。 分类：分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子 第60页，共101页。培养基各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求第61页，共101页。n1、选择适宜的营养物质n2、营养物的浓度

35、及配比合适n3、物理、化学条件适宜n4、经济节约n5、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则培养基的设计原则第62页，共101页。实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或一般培养：肉

36、汤培养基或LBLB培养基；培养基；自然转化：基础培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；第63页，共101页。n枯草杆菌枯草杆菌BF7658-BF7658-淀粉酶发酵培养基淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398AS1.398中性蛋白酶发酵培养基中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0

37、.03%（自然pH）。n黑曲霉糖化酶发酵培养基黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。n地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌27092709碱性蛋白酶发酵培养基碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。n黑曲霉黑曲霉AS 3.350AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 n游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷

38、酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。n桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。n黑曲霉黑曲霉AS3.396AS3.396果胶酶发酵培养基果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸

39、铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)回本节第64页，共101页。2 2、发酵条件及控制、发酵条件及控制npHpH值的调节控制值的调节控制 n温度的调节控制温度的调节控制 n溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制 第65页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制npHpH值的调节控制值的调节控制n不同的细胞，其生长繁殖的最适不同的细胞，其生长繁殖的最适pHpH值有所不同。一般值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适细菌和放线菌的生长最适pHpH值在中性或碱性范围值在中性或碱性范围（p

40、H6.5pH6.58.08.0）；霉菌和酵母的最适生长）；霉菌和酵母的最适生长pHpH值为偏酸值为偏酸性性(pH4(pH46)6)；植物细胞生长的最适；植物细胞生长的最适pHpH值为值为5 56 6。第66页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制npHpH值的调节控制值的调节控制n细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pHpH值与生长最适值与生长最适pHpH值往往有所不同。细值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适胞生产某种酶的最适pHpH值通常接近于该酶催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适pHpH值。值。n有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养有些细胞可以同时产生若干

41、种酶，在生产过程中，通过控制培养基的基的pHpH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如，采用米值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的pHpH值为碱性时，主要生产碱值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的性蛋白酶；培养基的pHpH值为中性时，值为中性时， 主要生产中性蛋白酶；而主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。第67页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制npHpH值的调节控制值的调节控制n培养基的培养基的pHpH值与培养基的组成成分以及发酵工艺

42、条件值与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。密切相关。n含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pHpH值向值向酸性方向移动；酸性方向移动；n含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使类物质，使pHpH值向碱性方向移动；值向碱性方向移动；n以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使硫酸根会使pHpH值降低；值降低；n以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使

43、培养基的pHpH值上升，值上升，然后又随着氨被细胞同化而使然后又随着氨被细胞同化而使pHpH值下降；值下降；第68页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制npHpH值的调节控制值的调节控制n磷酸盐的存在，对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。n在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的pH值向酸性方向移动。第69页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n发酵过程中，对培养基pH值进行适当的控制和调节方法:n调节pH值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；n也可以使用缓冲液来稳定pH值；n或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求

44、。第70页，共101页。第71页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n温度的调节控制温度的调节控制n不同的细胞有不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适不同的细胞有不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适生长温度为生长温度为34343737，黑曲霉的最适生长温度为，黑曲霉的最适生长温度为282832 32 等。等。第72页，共101页。通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。温度的控制温度的控制有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶

45、所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。 第73页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n温度的调节控制温度的调节控制n温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。温度调控的需要。第74页，共101

46、页。发酵条件及控制发酵条件及控制n溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制 n细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。第75页，共101页。溶解氧的控制溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。 培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液

47、接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。回本节第76页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制调节通气量调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质 控制溶解氧方法第77页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制n调节气液接触面积的措施调节气液接触面积的措施:n为了增大气液两相接触面积，应是通过培养液的空气尽量为了增大气液两相接触面积，应是通过培养液的空气尽量分散成小气泡。分散成小气泡。n在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分

48、散成小气泡在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培养液中，是增加气液接触面积的主要方法。进入培养液中，是增加气液接触面积的主要方法。n装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散，也可装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散，也可以有效地增加气液接触面积，从而提高溶氧速率。以有效地增加气液接触面积，从而提高溶氧速率。第78页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制n改变培养液的性质： n可以通过改变培养液的组分或浓度等方法，有效地降低培养液的黏度；设置消泡装置或添加适当的消泡剂，可以减少或消除泡沫的影响，以提高溶氧速率。第79

49、页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n提高酶产量的措施提高酶产量的措施n添加诱导物添加诱导物n控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度 n添加表面活性剂添加表面活性剂 n添加产酶促进剂添加产酶促进剂 第80页，共101页。提高酶产量的措施提高酶产量的措施 添加诱导物添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。 诱导物一般可以分为3类 酶的作用底物酶的作用底物 酶的催化反应产物酶的催化反应产物 作用底物的类似物作用底物的类似物第81页，共101页。发

50、酵条件及控制发酵条件及控制n提高酶产量的措施提高酶产量的措施n添加诱导物添加诱导物n1. 1. 酶的作用底物酶的作用底物n许多诱导酶都可以由其作用底物诱导产生。例如，乳糖诱导大肠杆许多诱导酶都可以由其作用底物诱导产生。例如，乳糖诱导大肠杆菌菌-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。L-L-苯丙氨酸诱导苯丙氨酸解氨酶的合成等苯丙氨酸诱导苯丙氨酸解氨酶的合成等第82页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n提高酶产量的措施提高酶产量的措施n添加诱导物添加诱导物n2. 2. 酶的反应产物酶的反应产物n有些酶可以由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸是果胶有些酶可以由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸

51、是果胶酶催化果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合酶催化果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合成；纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成；没食子酸诱导单宁酶的产成；纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成；没食子酸诱导单宁酶的产生等。生等。 第83页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n提高酶产量的措提高酶产量的措施施n添加诱导物添加诱导物第84页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n提高酶产量的措施提高酶产量的措施n添加诱导物添加诱导物第85页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n提高酶产量的措施提高酶产量的措施n添加诱导物添加诱导物n酶作用底物的类似物n有些酶的

52、最有效的诱导物是可以与酶结合，但不能被酶催化的底物类似物。例如，异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍； 第86页，共101页。控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。1.1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用质经过分解代谢而产

53、生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 第87页，共101页。添加表面活性剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的

54、产量。从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活性剂非离子型表面活性剂，如吐温（吐温（TweenTween）、曲通曲通(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 回本节第88页，共101页。第89页，共101页。添加表面活性剂添加表面活性剂第90页，共101页。发酵条件及控制发酵条件及控制n提高酶产量的措施提高酶产量的措施n添加产酶促进剂添加产酶促进剂n产酶促进剂是指可以促进

55、产酶、但是作用机理未阐明清楚的产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。例如，添加一定量的植酸钙镁，往可以显著提高酶的产量。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1 12020倍倍, ,添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度要通过试验确定

56、所添加的产酶促进剂的种类和浓度。 第91页，共101页。酶生产过程的动力学酶生产过程的动力学1、酶生物合成的模式2、酶生产过程中细胞生长动力学3、酶生产过程中产酶动力学GoGoGo本章目录第92页，共101页。酶生产过程的动力学酶生产过程的动力学n酶发酵动力学酶发酵动力学 n发酵动力学主要研究发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。 第93页，共101页。1 1、酶生物合成的模式、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等衰退期等4

57、4个阶段个阶段 通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型同步合成型，延续合成型延续合成型，中期合成型中期合成型和滞后合成型。滞后合成型。 第94页，共101页。同步合成型同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系， 又称为生长偶联型生长偶联型。 属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。 大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱

58、导酶也按照此种模式进行生物合成。进行生物合成。 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。 第95页，共101页。延续合成型延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。续合成一段较长时间。 属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。 第96页，共101页。中期合成型中期合成型 该类型的