生物学核酸化学

1、会计学1生物学核酸化学生物学核酸化学碱基碱基 互变异构互变异构 戊糖戊糖 核苷核苷 部部分分核核苷苷的的结结构构 核苷酸核苷酸 细细胞胞内内游游离离核核苷苷酸酸及及其其衍衍生生物物 环化核苷酸环化核苷酸 二、核酸的分子结构二、核酸的分子结构 核酸的一级结构核酸的一级结构 核苷酸序列都是按照核苷酸序列都是按照53方向读写方向读写 pApTpCpApG 字母简化式字母简化式 线条简化式线条简化式 一级结构测定一级结构测定 片断重叠法（经典法）片断重叠法（经典法） 用酶降解核酸成片断，测各段组成及序列用酶降解核酸成片断，测各段组成及序列 找出重叠片断，推断整个序列找出重叠片断，推断整个序列 再用另一

2、种酶降解核酸，测各段组成及序列再用另一种酶降解核酸，测各段组成及序列 直读法（化学断裂法）直读法（化学断裂法） 用同位素标记（用同位素标记（5-OH），），降解，降解，电泳分离，电泳分离，放射自显影，放射自显影，图谱中推测序列图谱中推测序列 DNA的二级结构的二级结构 DNA分子的碱基组成特点分子的碱基组成特点 A=T G=C A+G=C+T不同生物来源的不同生物来源的DNAA+T/G+C比值的不同比值的不同 同一生物的不同组织的同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同碱基组成相同 DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或环境变化而改变碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或环境变化而改变 DNA

3、双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点 1、两条反向平行的多脱氧核苷酸链形成右手双螺旋结构、两条反向平行的多脱氧核苷酸链形成右手双螺旋结构 2、双螺旋的直径是、双螺旋的直径是2nm 一圈需一圈需10个核苷酸残基个核苷酸残基 螺距为螺距为3.4nm 3、脱氧核糖和磷酸构成的骨架结构位于双螺旋的外侧，、脱氧核糖和磷酸构成的骨架结构位于双螺旋的外侧， 碱基位于内侧。碱基位于内侧。 碱基平面与双螺旋的中轴垂直，碱基平面与双螺旋的中轴垂直， 糖环平面则与中轴平行糖环平面则与中轴平行 4、互补链以氢链相连，匹配成对、互补链以氢链相连，匹配成对 维持螺旋结构稳定性的作用力维持螺旋结构稳定性的作用力 碱基堆

4、积力碱基堆积力 氢键氢键 盐键盐键 DNA双螺旋结构的多态性双螺旋结构的多态性 B-DNA A-DNA C-DNA Z-DNA 三三种种DNA分分子子模模型型 结构参数结构参数螺旋类型螺旋类型A-DNAA-DNAB-DNAB-DNAC-DNAC-DNAZ-DNAZ-DNA结晶状态结晶状态75%75%相对湿相对湿度度钠盐钠盐92%92%相对湿相对湿度度钠盐钠盐66%66%相对湿相对湿度度锂盐锂盐螺旋方向螺旋方向右右右右右右左左螺距螺距2.82.83.43.43.13.14.54.5碱基对之间距离碱基对之间距离(nm)(nm)0.2560.2560.340.340.3320.3320.370.37

5、每圈螺旋的碱基对每圈螺旋的碱基对数数111110109.39.31212碱基夹角碱基夹角32.732.7 3636 3838 6060 碱基平面倾斜度碱基平面倾斜度2020 0 06 6 7 7 螺旋直径螺旋直径2.32.32.02.01.81.8三链三链DNA(也称三股螺旋也称三股螺旋DNA) 与与DNA碱基顺序相关的特殊二级结构碱基顺序相关的特殊二级结构 DNA的三级结构的三级结构 DNA超螺旋超螺旋原核生物原核生物DNA的高级结构的高级结构 DNA在在真真核核细细胞胞内内的的组组装装 核核小小体体是是构构成成染染色色质质的的基基本本结结构构单单位位 串珠状结构串珠状结构 DNA的功能的功

6、能 RNA的空间结构与功能的空间结构与功能 作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板 RNARNA的种类的种类简写简写存在部位存在部位 功功 能能细胞核细胞核细胞质细胞质线粒体线粒体核蛋白体核蛋白体RNARNArRNArRNA+ + + +核蛋白体的组成成份核蛋白体的组成成份信使信使RNARNAmRNAmRNA+ + + +蛋白质合成的摸板蛋白质合成的摸板转运转运RNARNAtRNAtRNA+ + + +运送氨基酸运送氨基酸催化活性催化活性RNARNA+ +- -？具有酶的功能，剪切具有酶的功能，剪切RNARNA核不均一核不均一RNARNAhnRNA

7、hnRNA+ +- - -成熟成熟mRNAmRNA的前体的前体核小核小RNARNAsnRNAsnRNA+ +- - -参与参与hnRNAhnRNA的剪接和转运的剪接和转运核仁小核仁小RNARNAsnoRNAsnoRNA+ +- - -rRNArRNA的加工和修饰的加工和修饰胞质小胞质小RNARNAscRNAscRNA7SL-RNA7SL-RNA- -+ +- -蛋白质在内质网定位合成蛋白质在内质网定位合成的信号识别体的组成成分的信号识别体的组成成分动物细胞内主要动物细胞内主要RNA的种类和功能的种类和功能 mRNA 原核生物和真核生物的原核生物和真核生物的mRNA结构差别结构差别 1、原核生物

8、的、原核生物的mRNA是多顺反子是多顺反子 一个一个mRNA分子编码两个或两个以上的不同蛋白质分子分子编码两个或两个以上的不同蛋白质分子 真核生物真核生物mRNA为单顺反子为单顺反子 一个一个mRNA分子只编码一个蛋白质分子分子只编码一个蛋白质分子 顺反子顺反子 遗传功能单位遗传功能单位 是一个多肽链的基因是一个多肽链的基因 2、真核生物成熟、真核生物成熟mRNA的的3端多聚端多聚A尾巴（尾巴（polyA尾巴）尾巴）100200个腺苷酸个腺苷酸 原核生物的原核生物的mRNA一般无一般无3-polyA 3、真核生物成熟、真核生物成熟mRNA的的5-端有端有m7GpppN的帽子结构的帽子结构 原核

9、生物原核生物mRNA起始密码子起始密码子AUG的上游有的上游有S-D序列序列 4、真核生物、真核生物mRNA的转录与翻译分开进行的转录与翻译分开进行原核生物原核生物mRNA合成时，边转录边翻译，合成时，边转录边翻译，mRNA边降解边降解 tRNA 氨基酸臂氨基酸臂 二氢尿嘧啶环二氢尿嘧啶环(DHU环，简称环，简称D环环) 反密码环反密码环 TC环环 额外环（可变环）额外环（可变环） rRNA 核糖体由大小两个亚基组成核糖体由大小两个亚基组成 其他其他RNA分子分子 三、核酸的性质三、核酸的性质一般物理性质一般物理性质 DNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，为白色粉末

10、状固体，都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等一般有机溶剂，都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等一般有机溶剂，可以用乙醇把核酸从水溶液中沉淀下来可以用乙醇把核酸从水溶液中沉淀下来 DNA是线性高分子，粘度极大，是线性高分子，粘度极大，而而RNA分子远小于分子远小于DNA，故粘度较小。，故粘度较小。变性时粘度降低变性时粘度降低 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收 20mg/ml寡核苷酸的浓度寡核苷酸的浓度 通常通常1个个OD值值相当于相当于50g/m1双链双链DNA浓度浓度或或40g/ml单链单链DNA(或或RNA)浓度浓度或或核酸的变性、复性和分子杂交核酸的变性、复性和分子杂交 核酸的变性与复性核酸的变性与复性

11、变成了两条无规卷曲的单链的过程变成了两条无规卷曲的单链的过程 某些理化因素的影响下某些理化因素的影响下双螺旋结构中的碱基对间的氢键受到破坏双螺旋结构中的碱基对间的氢键受到破坏变性后的变性后的DNA粘度下降，粘度下降，浮力密度升高，浮力密度升高，光学性质改变，光学性质改变，生物活性部分或全部丧失生物活性部分或全部丧失 变性后的特征变性后的特征DNA热变性热变性 紫外吸收值达到最大吸收值紫外吸收值达到最大吸收值(完全变性完全变性)一半一半(双螺旋结构失去一半双螺旋结构失去一半)时的温度时的温度DNA的变性温度的变性温度 又称又称DNA的熔点或熔解温度的熔点或熔解温度用用Tm 表示表示 DNA的的T

12、m值值与与G-C含量含量的关系的关系 变性变性DNA 的复性的复性 热变性热变性DNA缓慢冷却缓慢冷却可以复性可以复性称为退火称为退火 增色效应增色效应 减色效应减色效应 DNA的变性与复性的变性与复性 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 分子杂交技术分子杂交技术 利用利用DNA变性与复性的原理变性与复性的原理 变性变性DNA复性重新形成双螺旋结构复性重新形成双螺旋结构 不同的不同的DNA单链分子或者单链分子或者DNA与与 RNA的混合物的混合物 形成杂化的双链形成杂化的双链 印迹技术印迹技术 存在于凝胶中的生物大分子存在于凝胶中的生物大分子转移转移(印迹印迹)于固定化介质上并加以检测分析的技术于固

13、定化介质上并加以检测分析的技术 常用的印迹技术常用的印迹技术 DNA印迹技术、印迹技术、RNA印迹技术、蛋白质印迹技术印迹技术、蛋白质印迹技术 DNA印迹技术主要用于基因组印迹技术主要用于基因组DNA的定性和定量分析的定性和定量分析 RNA印迹技术可以用来确定特异印迹技术可以用来确定特异RNA的大小的大小,半定量分析半定量分析 免疫印迹技术用于检测特异蛋白质的存在、半定量分析免疫印迹技术用于检测特异蛋白质的存在、半定量分析 印印迹迹技技术术示示意意图图 探针技术探针技术 是经过特殊标记的核酸片段，是经过特殊标记的核酸片段，它具有特定的序列，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，能够与

14、待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的特定基因因此可用于检测核酸样品中的特定基因 常用探针常用探针 探针探针DNA探针探针 RNA探针探针 四、核酸的分离、纯化和鉴定四、核酸的分离、纯化和鉴定 一般原则一般原则 一般根据核酸来源和种类不同而选择不同的方法，一般根据核酸来源和种类不同而选择不同的方法，但但总的要求总的要求是除去蛋白质等各种杂质，是除去蛋白质等各种杂质，保持核酸不发生变性或降解，保持核酸不发生变性或降解，最终得到完整而具有天然生物活性的核酸制品最终得到完整而具有天然生物活性的核酸制品 提取核酸主要步骤提取核酸主要步骤 实验材料的获得，包括细菌、细胞的培养或组织器官提取实

15、验材料的获得，包括细菌、细胞的培养或组织器官提取收集和裂解组织或细胞，释放出核酸收集和裂解组织或细胞，释放出核酸核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化保持低温保持低温(04) 避免剧烈的机械作用避免剧烈的机械作用 分离核酸的一般过程分离核酸的一般过程抽提和沉淀核酸抽提和沉淀核酸 细胞组织破碎细胞组织破碎解聚核蛋白并使蛋白质变性解聚核蛋白并使蛋白质变性去除蛋白和多糖等杂质去除蛋白和多糖等杂质根据所需纯化的核酸性质确定纯化方法根据所需纯化的核酸性质确定纯化方法 DNA的分离纯化的分离纯化 除蛋白方法除蛋白方法 真核细胞中真核细胞中DNA以核蛋白形式存在以核蛋白形式存在 去垢剂法去垢剂法 十二烷基硫酸钠十

16、二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂可使蛋白质变性等去污剂可使蛋白质变性 苯酚抽提法苯酚抽提法 使蛋白质迅速变性使蛋白质迅速变性 抑制核酸酶对抑制核酸酶对DNA的降解的降解 三氯甲烷三氯甲烷-戊醇抽提法戊醇抽提法 酶法酶法 分离不同构象的分离不同构象的DNA蔗糖梯度区带离心法蔗糖梯度区带离心法 按照按照DNA分子量的大小和形状进行分离分子量的大小和形状进行分离 氯化铯密度梯度平衡超离心法氯化铯密度梯度平衡超离心法 羟基磷灰石和甲基白蛋白硅藻土柱层析羟基磷灰石和甲基白蛋白硅藻土柱层析 RNA的分离与纯化的分离与纯化 核酸纯度鉴定核酸纯度鉴定 紫外吸收法紫外吸收法 定磷法定磷法 定糖法定糖法 核糖的测定

17、核糖的测定 地衣酚地衣酚(3,5-二羟甲苯二羟甲苯)反应反应 脱氧核糖的测定脱氧核糖的测定 与二苯胺反应与二苯胺反应 试设计方案分离这三种蛋白质试设计方案分离这三种蛋白质 复习题复习题1、在一抽提液中含有三种蛋白质、在一抽提液中含有三种蛋白质A B C分子量分子量 20,000 21,000 5,000等电点等电点 8.5 5.9 6.02、有两个、有两个DNA分子，如果发生热变性，哪一个分子分子，如果发生热变性，哪一个分子Tm值高？值高？如果再复性，哪一个如果再复性，哪一个DNA复性到原来的复性到原来的DNA结构可能性更大些结构可能性更大些? 5ATATATATAT3 3TATATATATA

18、55TAGGCGATGC3 3ATCCGCTACG53、说明在、说明在pH2.5、pH3.5、pH6、pH8、pH11.4时，时，四种核苷酸（四种核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）所带的电荷数）所带的电荷数（或所带电荷数多少的比较）；（或所带电荷数多少的比较）；电泳分离四种核苷酸时，缓冲液应取哪一个电泳分离四种核苷酸时，缓冲液应取哪一个pH比较合适？比较合适？此时他们是向正极还是向负极移动？移动的快慢顺序如何？此时他们是向正极还是向负极移动？移动的快慢顺序如何？ 4、从组成、结构、性质、功能几方面比较两类核酸的异同点、从组成、结构、性质、功能几方面比较两类核酸的异同点 当要把上述四种核苷酸吸附于阴离子交换树脂柱上时，当要把上述四种核苷酸吸附于阴离子交换树脂柱上时，应调到什么应调到什么pH值？值？如果洗脱液对阴离子交换树脂上的四种核苷酸如果洗脱液对阴离子交换树脂上的四种核苷酸进行洗脱分离时，洗脱液又应调到什么进行洗脱分离时，洗脱液又应调到什么pH值？值？这四种核苷酸的洗脱顺序如何？为什么？这四种核苷酸的洗脱顺序如何？为什么？二、核酸的分子结构二、核酸的分子结构 核酸的一级结构核酸的一级结构 核苷酸序列都是按照核苷酸序列都是按照53方向读写方向读写 pApTpCpApG 字母简化式字母简化式 线条简化式线条简化式 结构参数结构参数螺旋类型螺旋类型A-DNAA-DNAB