生物学分子生物学DNA复制

1、会计学1生物学分子生物学生物学分子生物学DNA复制复制DNA replication第第1节节 DNA复制概述复制概述一、半保留机制一、半保留机制 二、复制子二、复制子(Replicons)和复制方向和复制方向三、半不连续复制三、半不连续复制 (semi-discontinous replication )四、四、RNA引导引导 (RNA priming )半保留复制半保留复制新合成新合成 的链的链Matthew Messelson Franklin Stahl单林娜 制作10 DNA replication E. ColiE. Coli DNA DNA在在1515N-N-标记标记的营养液中生

2、的营养液中生长多代，使长多代，使DNADNA双链充分标记双链充分标记万有引力万有引力将将1515N-N-标记标记的的E.ColiE.Coli 加入加入1414N N 培培养液中养液中细胞在细胞在1414N N中中复制复制1 1次次细胞在细胞在1414N N中复中复制第制第2 2次次细胞在细胞在1414N N中复中复制第制第3 3次次复制子复制子(复制单位或复制元复制单位或复制元 ) ：能独立进行复制的：能独立进行复制的DNA 单位，单位，从起始位点到终止位点的全部从起始位点到终止位点的全部DNA。Origin(复制起始位点复制起始位点):复制开始处复制开始处DNA分子的特定位置分子的特定位置。

3、(富含富含AT)Terminus(复制终止点复制终止点) 复制终止处复制终止处DNA分子的特定分子的特定位置。位置。DNA replication二、复制子二、复制子(Replicons)和复制方向和复制方向1.复制子复制子l 原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位 单林娜 制作14 All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications. （单复制（单复制子）子）真核生物（真

4、核生物（EukaryoteEukaryote） : : 多复制起点多复制起点，即一个，即一个genomegenome中有中有多个复制单多个复制单位位2 2、复制方向（复制过程的顺序性）、复制方向（复制过程的顺序性）l 复制叉（复制叉（Replication fork）：复制时DNA分子中的叉形结构，是由解开的两条链和尚未松解开的双螺旋形成的，是复制有关的酶和蛋白质组装成复合物和新链合成的部位。 l replication bubbles(复制泡复制泡)：两个靠得很近的复制叉之间形成的空间。Replication forkorigins of DNA replication (every 150

5、 kb)replication bubbledaughter chromosomesfusion of bubblesbidirectional replicationOrigins of DNA replication on mammalian chromosomes5 3 3 5 5 3 3 5 3 5 5 3 Electron Microscopy of replicating DNA reveals replicating bubbles. 单向复制单向复制 双向复制双向复制 （1 1）单双向复制取决于起点处有一个）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉还是两个复制叉单单起点、起点

6、、单单方向（原核）方向（原核）多多起点、起点、单单方向（真核）方向（真核）单单起点、起点、双双方向方向(原核原核)多多起点、起点、双双方向（真核）方向（真核）（2 2） 复制的多模式复制的多模式 Bidirectional (双向复制双向复制) replication of a circular bacterial repliconorignterminidaughter DNAA single termination site is roughly 180o opposite the unique origin3 5 OK !How ?5 3 5 3 三、半不连续复制三、半不连续复制 (se

7、mi-discontinous replication ) DNA聚合酶只能以53方向合成DNA， 事实上没有发现DNA能按35合成的证据E.coli t- 2, 7, 15, 30 脉冲标记脉冲标记 dT-H3 0 0 KCN 杀死杀死D.S. DNA S.S. DNA 密度梯度离心密度梯度离心 测定测定 H3-T 放射强度放射强度脉冲追踪脉冲追踪 20 in dT-H3 30 正常培养基中数分钟正常培养基中数分钟 冈崎片段（冈崎片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment）19681968 D.S. DNA 5Okazaki fragmentlagging str

8、andlagging strand（后随链（后随链):):单林娜 制作30 DNA replication四四 、RNA引导引导The first few nucleotides(核苷酸核苷酸) at the 5-end of Okazaki fragments are ribonucleotides(核糖核苷核糖核苷酸酸). Hence, DNA synthesis is primed by RNA that is then removed before fragments are joined. Crucial for high fidelity(忠实性忠实性) of replicatio

9、nDNA replication第第2节节 细菌细菌DNA的复制的复制一、一、 DNA复制所需的蛋白质和酶复制所需的蛋白质和酶二、二、 DNA复制的过程复制的过程三、三、 DNA复制的方式复制的方式种种 类类功功 能能DnaA辨认起始点，并结合到复制起始部位辨认起始点，并结合到复制起始部位DnaB解开解开DNA双链双链DnaC运送和协同运送和协同DnaB性质 聚合酶聚合酶 聚合酶3 5 外切活性+ + + +5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生链合成-+主要是对主要是对DNADNA损伤的修损伤的修复；以及在复；以及在DNADNA复制时复制时切除切除RNARNA引物并填

10、补其引物并填补其留下的空隙。留下的空隙。修复紫外修复紫外光引起的光引起的DNADNA损伤损伤DNA DNA 复制的主要复制的主要聚合酶，还具有聚合酶，还具有3 3-5-5 外切酶的外切酶的校对功能，提高校对功能，提高DNADNA复制的保真性复制的保真性DNA polymerase III holoenzyme 单林娜 制作51 3 3 55 外切酶活性：外切酶活性：切除错配的核苷酸切除错配的核苷酸5 5 33 外切酶活性：外切酶活性： 切除引物切除引物 切除突变的片段切除突变的片段C T T C A G G AG A A G T C C G G C G5335单林娜 制作58 单林娜 制作HU

11、 ATPDnaA 13bp segments OriC Supercolled template 1 单林娜 制作59 1. 起始复合体：随同HU蛋白一起，2040个dnaA protein-ATP 复合体结合到DNA上，包围4个9-mers区HU ATPDnaA 13bp segments OriC Supercolled template 1 单林娜 制作2. 开放性复合体：开放性复合体：DnaA 蛋白使蛋白使13bp重重复单位熔解而形成开放复单位熔解而形成开放性复合体，这一过程需性复合体，这一过程需要要ATP 。3. 前引发复合体：前引发复合体：这时这时DnaB 和和DnaC蛋蛋白进入白

12、进入DNA的熔解区的熔解区与与OriC结合形成前引结合形成前引发复合体。发复合体。 4. 单链结合蛋白结合，单链结合蛋白结合，稳定稳定OriC的单链结构的单链结构引发和复制引发和复制2 DnaB DnaC ATP DnaC DnaB 3 4 38 解旋酶解旋酶 (DnaB) 解开解开DNA链。链。SSB结合稳定其单链结构结合稳定其单链结构 旋转酶解除链的张力旋转酶解除链的张力 .Primase 合成一段合成一段RNA引物引物 Dna A Dna B、 Dna CDNA topoisomerase引物引物酶酶SSB3 5 3 5 Prismosome and primer3 5 3 5 引物是由

13、引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶Re-initiation of bacterial replication at new origins before completion of the first round of replication 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-polLeading strand elongation strand elongation回环模型：回环模型：后随链模后随链模板绕聚合酶形成板绕聚合酶形成180。的回环，穿过。的回环

14、，穿过DNA聚合酶聚合酶III的裂缝，使的裂缝，使两条模板链在此处呈两条模板链在此处呈相同的相同的35方向。随方向。随着后随链模板在聚合着后随链模板在聚合酶中穿行，聚合酶便酶中穿行，聚合酶便从引物从引物3端合成冈崎端合成冈崎片段。片段。阶段一阶段一阶段二阶段二形成回环，与聚合酶的一形成回环，与聚合酶的一个亚单位和引发体结合，个亚单位和引发体结合，准备开始合成引物准备开始合成引物引物行进引物行进5 3方向的合成，与方向的合成，与复制叉行进的方向一致复制叉行进的方向一致阶段三阶段三阶段四阶段四环不断扩大，在引物环不断扩大，在引物3-OH端端开始合成开始合成DNA片段，合成方片段，合成方向为向为5

15、3当当DNA新片段合成到距离前一新片段合成到距离前一片段的片段的5端仅剩一小空隙是，端仅剩一小空隙是，解环，新合成的片段移到与复解环，新合成的片段移到与复制叉行进相反的方向。制叉行进相反的方向。Elongation: lagging strand replication Polymerase III holoenzyme(DNA pol III)DNA pol I (53 exonulclease activity)DNA pol I (53 polymerase activity)DNA ligase单林娜 制作73 4-14拓扑旋转酶拓扑旋转酶解旋酶解旋酶引发体引发体冈崎片段冈崎片段引物引

16、物Pol SSBPolDNA连接酶连接酶单林娜 制作75 Termination of E. coli DNA replicationtrap顺时针复制叉顺时针复制叉反时针复制叉反时针复制叉陷阱陷阱 Tus protein: 终止位点结合蛋白终止位点结合蛋白, 单林娜 制作80 相连的染色体相连的染色体滚环复制模型滚环复制模型1968年Gilbert提出：模板链和新合成的链模板链和新合成的链分开分开;不需不需RNA引物，在正引物，在正链链3OH上延伸上延伸只有一个复制叉只有一个复制叉;单向复制的特殊方式单向复制的特殊方式DNA polymeraseLocation位置位置nuclear细胞核n

17、uclear细胞核mitochondrion线粒体 nuclear nuclearActivity活性活性5 3的聚的聚合酶活性合酶活性;引物酶活性引物酶活性 5 3的聚合的聚合酶活性酶活性5 3的聚合的聚合酶活性；酶活性； 3 5的外切活性的外切活性5 3的聚的聚合酶活性；合酶活性； 3 5的外切的外切活性活性,需要需要PCNA5 3的聚的聚合酶活性；合酶活性； 3 5的外的外切活性切活性Function功能功能引发Repair修复修复mDNA replication前导链和后随链的合成Repair修复修复PCNA:增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原不同区域的染色质起始复制的时间不同不同区域的染色

18、质起始复制的时间不同Licensing factor controls eukaryotic replication（）(1) Initiation (起始起始)u 酵母复制起始位点酵母复制起始位点 (ARS- autonomously replicating sequences(自主复制序列自主复制序列), enables the prokaryotic plasmids to replicate in yeast).Minimal sequence of ARS: 11 bp A/TTTTATA/GTTTA/T (TATA box)u ORC (origin recognition com

19、plex 起始点识别复合物起始点识别复合物) binds to ARS, upon activation by CDKs, ORC will open the DNA for replication.Yeast replication initiation Replication fork复制之前需从核小体上解下复制之前需从核小体上解下DNA : 50 bp/sec, helicases(解旋酶解旋酶) and RP-A (单链结合蛋白单链结合蛋白)单林娜 制作5.45.4 Eukaryotic DNA replication Elongation: 三种不同的三种不同的DNA聚合酶聚合酶.1

20、. DNA pol a a: 具有引发酶活性，用于合成具有引发酶活性，用于合成RNA引物引物 and synthesizes RNA primers. 继续延伸继续延伸DNA链，链，但很快被其他但很快被其他DNA聚合酶所取代聚合酶所取代. 2. DNA pol d d: 用于前导链和后随链的合成用于前导链和后随链的合成)3. DNA pol e e: RNA引物切除后，用于填补缺口引物切除后，用于填补缺口).5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 单林娜 制作20世纪的世纪的80年代中期发现了端粒酶，它是一种年代中期发现了端粒酶，它是一种RNA-蛋白质复合物。蛋白质复合物

21、。 端粒酶中的端粒酶中的RNA序列常可与端粒区的重复序列互补并作为端粒区重复序列延序列常可与端粒区的重复序列互补并作为端粒区重复序列延长的模板。长的模板。 端粒酶中的蛋白质部分具有逆转录酶活性，能以其自身携带的端粒酶中的蛋白质部分具有逆转录酶活性，能以其自身携带的RNA为模板逆为模板逆转录合成端粒转录合成端粒DNA。5.45.4 Eukaryotic DNA replication DNA末端末端1.RNA和和DNA单链单链互补序列识别结合互补序列识别结合2.以以RNA为模板为模板 的逆转录过程的逆转录过程3.再发动新一轮的合成延长再发动新一轮的合成延长,合成较长的重复序列合成较长的重复序列DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工DNA pol