生物大分子制备蛋白质酶分离纯化

1、会计学1生物大分子制备蛋白质酶分离纯化生物大分子制备蛋白质酶分离纯化目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。电泳、层析和高速与超速离心。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎。影响提取的因素主要有：影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；由固相扩散到液相的难易；溶剂的溶剂的pH值和提取时间等。值和提取时间等。注意：注意：提取时所选择的条件应有利于目的产物

2、溶解度的增加和提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。保持其生物活性。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：1)溶解度大：溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下，因而盐析操作也要求在低温下(04)进行。由下表可以看进行。由下表可以看到，硫铵在到，硫铵在0时的溶解度，远远高于其它盐类：时的溶解度，远远高于其它盐类： 几种盐在不同温度下的溶解度几

3、种盐在不同温度下的溶解度 (g/100ml水水) 0 20 80 100 (NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 1012)分离效果好：分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去除去75的杂蛋白，纯度提高了的杂蛋白，纯度提高了4倍。倍。3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用有的酶或蛋有的酶或蛋白质用白质用23mol/L浓度的浓度的(NH4)2SO4保存可达数年之久。保存可达数年之久。4

4、)价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。热变性热变性 利用生物大分子利用生物大分子的的热稳定性差异，加热升高温热稳定性差异，加热升高温度度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。表面活性剂和有机溶剂变性表面活性剂和有机溶剂变性使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。选择性酸碱变性选择性酸碱变性 利用对利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分

5、离纯化步骤。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。受压的生物大分子和小分子溶液浓缩的生物大分子小分子溶液三相点相图三相点相图 溶液冰冻：溶液冰冻：可用干冰可用干冰-乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形成很成很薄的冰冻层，可以大大加快冻干的速度。薄的冰冻层，可以大大加快冻干的速度。(1) 特点：特点：(2) 对所选方法的要求：对所选方法的要求：(2) 要注意的一些问题：要注意的一些问题：盐析后要及时脱盐。盐析后要及时脱盐。用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10

6、1/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。也可以使用串联柱以加大柱床体积。必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，例如：分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两例如：分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等。次凝胶过滤、离子交换层析等。影响生物大分子样品保存的主要因素有：影响生物大分子样品保存的主要因素有：2 蛋白质（酶）的蛋白质（酶）的分离纯化分离纯化2.1 酶活性测定酶活性测定2.2 酶溶液制备酶溶液制备2.3 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程2.4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法根据分子大小轻重建立的分离纯化方法2.5 调节

7、溶解度的分离方法调节溶解度的分离方法2.6 按电荷的正负性设计的分离方法按电荷的正负性设计的分离方法2.7 根据亲和作用建立的纯化方法根据亲和作用建立的纯化方法2.8 根据稳定性的差异建立的分离纯化方法根据稳定性的差异建立的分离纯化方法2.9 蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题: :酶酶转换率转换率 (1/s)酶酶转换率转换率 (1/s)碳酸酐酶碳酸酐酶 600,000凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶 100乙酰胆碱脂酶乙酰胆碱脂酶 25,000DNA聚合酶聚合酶 5青

8、霉素酶青霉素酶 2,000Trp合成酶合成酶 2乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 1,000溶菌酶溶菌酶 0.5 酶法酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：如葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖葡萄糖 + O2 葡萄糖内脂葡萄糖内脂 + H2O2欲测定葡萄糖内脂和欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应化物酶和木酚，使发生下列反应:由于由

9、于4-甲氧联酚在甲氧联酚在 435nm 波长处有光吸收峰，因此、波长处有光吸收峰，因此、只要测定只要测定 A435，就可知，就可知 4-甲氧联酚的量，可得甲氧联酚的量，可得H2O2的量，的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶 (过氧化物酶过氧化物酶) 必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在也应在 5 倍以上。倍以上。偶联法中偶联酶对反应速度的影响偶联法中偶联酶对反应速度的影响再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖葡萄糖 ATP 葡萄糖葡萄糖-6

10、-P其偶联其偶联-指示剂为葡萄糖指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶 葡萄糖葡萄糖-6-P + NADP+ 6-P-葡萄糖酸葡萄糖酸 + NADPH + H+这时即可测定这时即可测定 340nm 处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性。糖激酶）的活性。酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。 酶酶 反应反应 观测方法观测方法乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸乳酸+NAD+ 丙酮酸丙酮酸+NADH+H+丙酮酸丙酮酸+NADH 乳酸乳酸+NAD+340nm波长处有波长处有NADH形成形成340nm波长处有

11、波长处有NADH减少减少糖苷酶糖苷酶(Glycosidase) Methylumbelvifery + glucoside 糖糖 + Methylumbeviferone甲基伞型酮甲基伞型酮 (Methylumbelviferone) 发出发出荧光荧光内纤维素酶内纤维素酶纤维素纤维素 低聚葡萄糖低聚葡萄糖黏度下降黏度下降己糖激酶己糖激酶葡萄糖葡萄糖 + mgATP 6-P-葡萄糖葡萄糖 + ADP + H+pH降低，用降低，用pH计计非专一性磷脂酶非专一性磷脂酶405nm波长有硝基苯酚生成波长有硝基苯酚生成醛缩酶以醛缩酶以1-P-甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定

12、酶活性法(1) 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 (SOD) 活力测定活力测定单位体积活力单位体积活力(u/ml) = (0.07 - 样品速率样品速率)/0.07100%)/50% 反应液总体积反应液总体积(反应液稀释倍数反应液稀释倍数/样液体积样液体积) 总活力总活力 = 单位体积活力单位体积活力(u/ml)原液总体积原液总体积2.2.2.5 其他其他在细胞破碎以后，某些亚细胞结构也受到损伤，常给抽提在细胞破碎以后，某些亚细胞结构也受到损伤，常给抽提系统带来不稳定的因素，因此有时还要加入一些物质。例如：系统带来不稳定的因素，因此有时还要加入一些物质。例如：加入蛋白酶抑制剂加入蛋白酶抑制剂,以防

13、止蛋白酶破坏目的酶；为防止氧化，加以防止蛋白酶破坏目的酶；为防止氧化，加入入Lys或维生素或维生素C、惰性蛋白及底物等。、惰性蛋白及底物等。 总之，打破细胞后，溶酶一般不难抽提。至于结合总之，打破细胞后，溶酶一般不难抽提。至于结合酶，其中有些和颗粒结合不太紧，在颗粒结构受损伤时酶，其中有些和颗粒结合不太紧，在颗粒结构受损伤时，抽提也不难。例如：，抽提也不难。例如：- 酮戊二酸脱氢酶、延胡索酸酶酮戊二酸脱氢酶、延胡索酸酶，可用缓冲液抽提出来；，可用缓冲液抽提出来；Cyt C可用可用0.145mol/L的的TCA溶液抽提出来。那些和颗粒结合紧密的酶，常以脂蛋白溶液抽提出来。那些和颗粒结合紧密的酶，

14、常以脂蛋白络合物形式存在，其中有的在作成丙酮粉以后，就可以络合物形式存在，其中有的在作成丙酮粉以后，就可以抽提出，有的却要使用强烈的手段，如正丁醇等处理。抽提出，有的却要使用强烈的手段，如正丁醇等处理。正丁醇兼有高度的亲脂性和亲水性（特别是磷酸盐），正丁醇兼有高度的亲脂性和亲水性（特别是磷酸盐），能破坏蛋白间的结合使酶进入溶液，如琥珀酸脱氢酶。能破坏蛋白间的结合使酶进入溶液，如琥珀酸脱氢酶。近年来，广泛采用表面活性剂，如胆脂酸盐、近年来，广泛采用表面活性剂，如胆脂酸盐、 Triton、Tween、Teepol、SDS等，抽提呼吸链酶系。链霉菌葡等，抽提呼吸链酶系。链霉菌葡萄糖异构酶的抽提，向菌

15、体悬浮液中加入萄糖异构酶的抽提，向菌体悬浮液中加入0.1十二烷十二烷基吡啶氯化铵，酶的抽出率提高到基吡啶氯化铵，酶的抽出率提高到 8 倍等（倍等（表表）。此外）。此外，有时使用促溶剂如高氯酸；有时还用酶处理，如脂肪，有时使用促溶剂如高氯酸；有时还用酶处理，如脂肪酶、核酸酶、蛋白酶等。酶、核酸酶、蛋白酶等。表面活性剂对葡萄糖异构酶抽提效果的影晌表面活性剂对葡萄糖异构酶抽提效果的影晌表面活性剂表面活性剂类型类型释出酶活力释出酶活力 总酶活力总酶活力 释出释出 (%) 无无1.210.611.3 十二烷基苯磺酸钠十二烷基苯磺酸钠阴离子阴离子2.410.123.8 十二烷基醇磺酸钠十二烷基醇磺酸钠阴离

16、子阴离子3.811.233.9 十六烷基吡啶氯化铵十六烷基吡啶氯化铵阴离子阴离子8.411.970.6 十二烷基吡啶氯化铵十二烷基吡啶氯化铵阳离子阳离子10.411.689.7 十六烷基甲基溴化铵十六烷基甲基溴化铵阳离子阳离子9.911.685.9 聚氯乙烯聚氯乙烯非离子型非离子型2.910.926.6材料材料絮凝处理絮凝处理絮凝结果絮凝结果 碱性蛋白酶 发酵液200ml，pH 6.4 碱性蛋白酶发酵液对照添加0.26%阳离子聚丙烯酰胺 (PAM) 分子量为200-300万, 终浓度为328-429l/L, 先加25%Al2(SO4)3, 终浓度为0.65-0.84%助凝, 再加同上PAM先加

17、Al2(SO4)3助凝剂 (同上), 再加分子量为400-500万, 0.0047% PAM, 终浓度为105 l/L先加明矾1.5-2.0%或AlCl36H2O 1%助凝, 再加PAM 60l/L絮凝, 加Na2HPO4 1.5%, CaCl2 2.5%, pH 8.0滤速0.8ml/5min滤速4.5ml/5min滤速29ml/5min滤速24ml/5min比硝酸盐凝胶滤速高5倍, 滤速500L/h 细菌-淀粉酶 1000ml，pH 6.9 细菌-淀粉酶 1000ml 黑曲霉8471糖化酶发酵 液100ml，pH4.0对照先加 Al2(SO4)3 25ml, 终浓度为0.47%助滤,再加分

18、子量为200万阳离子 PAM (0.13%) 300ml, 终浓度为294l/L絮凝,先加碱式氯化铝 1.7%, PAM 0.35% (350l/L)絮凝先加30%碱式氯化铝 4ml, 再加分子量为700万PAM 0.2% (终浓度74l/L)收集滤液20ml絮凝需23min20ml需35min滤速比磷酸盐絮凝高1倍, 为81.5ml/min滤速为对照的1.7倍,酶活损失10% 赖氨酸发酵液 含固形物2.78%，100ml pH5-6 高温-淀粉酶 pH 6.5-7对照加阳离子PAM (分子量为400万) 1.6ml (终浓度为32l/L)先加30%碱式氯化铝 2ml, (终浓度为0.36-0

19、.75%), 再加分子量为1,140万阳离子PAM 2.5ml (终浓度为20l/L)上述絮凝液再加1%硅藻土先加Al2(SO4)3 1%助滤, 再加壳聚糖絮凝剂滤速100ml 需220min收集滤液100ml, 需60min收集滤液100ml, 需60min滤速提高20倍2.2.4.2 蒸发法蒸发法通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的酶溶液在高度真空下

20、转变成极薄的液膜，液膜通过加热酶溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种，根据物料不同而加以选择。式、离心式等多种，根据物料不同而加以选择。超滤膜主要有以下几种类型：超滤膜主要有以下几种类型：(1) 平面膜平面膜 将膜平铺在多孔支持板上，加压下（可带有搅拌）酶溶液从将膜平铺在多孔支持板上，加压下（可带有搅拌）酶溶液从膜面流过，水及小分子溶质透过膜孔而排比，大分子溶质（如酶膜面流过，水

21、及小分子溶质透过膜孔而排比，大分子溶质（如酶）被截留。）被截留。(2) 管式膜管式膜 将管式膜置于多孔硬管的外侧或内侧，酶溶液在管内或管外将管式膜置于多孔硬管的外侧或内侧，酶溶液在管内或管外流动，水和小分子溶质透过滤膜，而大分子物质被截留而浓缩。流动，水和小分子溶质透过滤膜，而大分子物质被截留而浓缩。(3) 中空纤维中空纤维将聚砜作成中空膜，成束中空纤维膜装在圆筒真空超滤器中将聚砜作成中空膜，成束中空纤维膜装在圆筒真空超滤器中。2.3 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程在上述浓缩液或发酵液中，除含有我们需要的酶以外，还不可避免地存在着其在上述浓缩液或发酵液中，除含有我们需要的酶以外，还不

22、可避免地存在着其他大分子物质和小分子物质他大分子物质和小分子物质，其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然而然的除其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然而然的除去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及其他蛋白质。核酸及其相关蛋白可以用硫酸去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及其他蛋白质。核酸及其相关蛋白可以用硫酸鱼鱼 精蛋白、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、三甲基氨十六烷基溴及精蛋白、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、三甲基氨十六烷基溴及MnCl2预先沉淀，离预先沉淀，离心除去、必要时，可用核酸酶。根据不同材料选择不同的试剂。比如从植物组织中心除去、必要时，可用核酸酶。根据不同材料选择不同的试剂。比如从植物组织中提取乙醇酸

23、氧化酶。可在提取液中提取乙醇酸氧化酶。可在提取液中0.1-0.2硫酸鱼精蛋白、使之与核酸及相关蛋白形硫酸鱼精蛋白、使之与核酸及相关蛋白形成复合物而沉淀，然后在成复合物而沉淀，然后在4采用采用10,500r/min离心而除去离心而除去.至于粘多糖，常用醋酸铅、至于粘多糖，常用醋酸铅、乙醇、单宁酸及离子型表面活性刑等处理除去，有时也用酶除去。余下酶和杂蛋白乙醇、单宁酸及离子型表面活性刑等处理除去，有时也用酶除去。余下酶和杂蛋白，因此，因此，酶的分离纯化工作主要是，将酶的分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去白从酶溶液中除去。现有酶的分离纯

24、化方法都是依据酶和。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。杂蛋白在性质上的差异而建立的。2.3.1 酶分离纯化方法的选择酶分离纯化方法的选择酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面，根据这些差异，其分离方法可有：根据这些差异，其分离方法可有：(1)根据根据分子大小分子大小、轻重设计轻重设计的方法，如离心分离法、筛的方法，如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。膜分离法、凝胶过滤法等。(2)根据根据溶解度大小溶解度大小分离的方法，如盐析法、有机溶剂沉淀法、分离的方法，如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法

25、等。共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(3)按分子按分子所带正负电荷所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。、电泳分离法、聚焦层析法等。(4)按按稳定性差异稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。法等。(5)按按亲和作用的差异亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等。建立的分离方法，如亲和层析法等。在在工作工作实践中选择方法时：实践中选择方法时：首先首先应对被纯化的酶应对被纯化的酶的理化性质（如溶解度、分子量大小、稳定性和解离的理化性质（如溶解度、分子量大小、稳定性

26、和解离时电学性质等）有一个比较全面的了解，时电学性质等）有一个比较全面的了解，这样，就可这样，就可以知道在分离纯化时可以选用以知道在分离纯化时可以选用哪哪些方法和条件，避免些方法和条件，避免使用哪些使用哪些方法和条件方法和条件，从而得到好的纯化效果从而得到好的纯化效果；其次其次，判断采用的方法和条件是否得当（判断的标准是酶活判断采用的方法和条件是否得当（判断的标准是酶活性的高低），性的高低），一个好的方法和条件是比活力提高的多一个好的方法和条件是比活力提高的多，总活力回收的多，而重复性好，在纯化工作中，往，总活力回收的多，而重复性好，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件，因为这样不能

27、使往不宜重复采用相同的步骤和条件，因为这样不能使纯度进一步提高，而只能使酶的总活力下降；纯度进一步提高，而只能使酶的总活力下降；再者再者要要严格控制操作条件，严格控制操作条件，随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降，酶亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降，酶更不稳定，因此，更要防止酶变性。更不稳定，因此，更要防止酶变性。在酶的分离纯化过程中在酶的分离纯化过程中，每步都须做三件事每步都须做三件事：第一第一，测定测定酶活力酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量；第三，测量体积体积(

28、ml)；然后将测得数据加以整理。；然后将测得数据加以整理。 2.3.2 酶分离纯化过程中一些数据的处理酶分离纯化过程中一些数据的处理步骤步骤总体积总体积(ml)总蛋白总蛋白(mg)总活力总活力(IU)比活力比活力(IU/mg)纯化倍数纯化倍数(X)产率产率(%) 1. 抽提抽提11036564682.10177.30- 2. 粗酶粗酶10145.547179.84324.401.83 3. Sephadex G-506523.338810.341665.689.40 4. SP C-504011.436563.453207.3218.10 5. 结晶结晶-6.2829642.344346.34

29、24.50引自引自生物化学与生物物理学报生物化学与生物物理学报，1993, 25(1):27。例如分离纯化番麻例如分离纯化番麻 (Agave americana) 蛋白酶的主要步骤蛋白酶的主要步骤为：叶片经为：叶片经30乙醇水溶液压榨提取，用冷丙酮制成干粉，乙醇水溶液压榨提取，用冷丙酮制成干粉，经经Sephadex G-50柱层析和柱层析和SP-Sephadex C-50纯化，获得结晶，纯化，获得结晶，纯化结果如表下表纯化结果如表下表:结晶形成的过程是自由能降至最小的过程。当自由能降至最小并逐渐达到平衡状态时，溶结晶形成的过程是自由能降至最小的过程。当自由能降至最小并逐渐达到平衡状态时，溶质分

30、子开始结晶作用，平衡状态的热力学和动力学参数决定于溶剂和溶质的理化特性。质分子开始结晶作用，平衡状态的热力学和动力学参数决定于溶剂和溶质的理化特性。当溶当溶液处于过饱和状态时液处于过饱和状态时，分子间的分散或排斥作用小于分分子间的分散或排斥作用小于分子间的相互吸引作用子间的相互吸引作用，便开始形成沉淀或结晶便开始形成沉淀或结晶，由于溶液的过，由于溶液的过饱和，维持水合物的水分子相对减少而且不足，溶质分子相互接触机会增加而聚集，但是，当饱和，维持水合物的水分子相对减少而且不足，溶质分子相互接触机会增加而聚集，但是，当溶液过饱和的速度过快时，溶质分子聚集太快，便会产生无定形的沉淀。如果控制溶液缓慢

31、地溶液过饱和的速度过快时，溶质分子聚集太快，便会产生无定形的沉淀。如果控制溶液缓慢地达到过饱和点，溶质分子就可能排列到晶格中，形成结晶。所以，在操作上必须达到过饱和点，溶质分子就可能排列到晶格中，形成结晶。所以，在操作上必须注意注意：第一：第一，耍，耍调整溶液调整溶液，使之缓慢地趋向于过饱和点；第二，使之缓慢地趋向于过饱和点；第二，调整溶液的性质和调整溶液的性质和环境条件环境条件，使尽可能多的溶质分子相互接触，形成结晶。，使尽可能多的溶质分子相互接触，形成结晶。 2.3.3 结晶结晶结晶是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周期性排列的一结晶是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周

32、期性排列的一种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋白分离的方法。白分离的方法。结晶的基本原理结晶的基本原理 2.3.3.1 结晶条件结晶条件酶蛋白分子形状和理化性质较复杂，使之在溶液酶蛋白分子形状和理化性质较复杂，使之在溶液中的特性也变得复杂，影响其最小溶解度的因素也很中的特性也变得复杂，影响其最小溶解度的因素也很多，如电解质的浓度、酶蛋白的浓度、多，如电解质的浓度、酶蛋

33、白的浓度、pH、温度等因、温度等因素；而且，由于常常出现几个最小溶解度，会产生结素；而且，由于常常出现几个最小溶解度，会产生结晶的多形性，从而使结晶条件也十分复杂；这样，每晶的多形性，从而使结晶条件也十分复杂；这样，每种酶蛋白的结晶条件也往往不同。种酶蛋白的结晶条件也往往不同。(1)酶的纯度酶的纯度 一般来说，酶越纯越容易获得结晶，长成单晶的可一般来说，酶越纯越容易获得结晶，长成单晶的可能性也越大能性也越大。除个别情况外除个别情况外，一般酶纯度应达到一般酶纯度应达到50以上以上。(2)酶蛋白的浓度酶蛋白的浓度 对大多数酶来说对大多数酶来说，蛋白质浓度在蛋白质浓度在3-50mg/ml较好较好。一

34、般来说，酶蛋白浓度越高，有利于分子间相互碰撞而聚合，一般来说，酶蛋白浓度越高，有利于分子间相互碰撞而聚合，但是酶蛋白浓度过高，往往形成沉淀；酶蛋白浓度过低，不易但是酶蛋白浓度过高，往往形成沉淀；酶蛋白浓度过低，不易形成晶核。形成晶核。(3)晶种晶种 有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶，有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶，在加入晶种前，要将溶液调整到适于结晶条件下，加入的晶种在加入晶种前，要将溶液调整到适于结晶条件下，加入的晶种开始溶解，还要追加沉淀剂，直到晶种不溶解为止，当达到晶开始溶解，还要追加沉淀剂，直到晶种不溶解为止，当达到晶种不溶解又没有无定形物形成时，静置，使

35、晶体生长。种不溶解又没有无定形物形成时，静置，使晶体生长。(4)温度温度 结晶温度，结晶温度， 一方面要有利于结晶的生成；另一方面要不一方面要有利于结晶的生成；另一方面要不超过酶的热稳定性。有些酶对温度很敏感，因此要防止酶失活超过酶的热稳定性。有些酶对温度很敏感，因此要防止酶失活，从现有资料来看，一般控制在，从现有资料来看，一般控制在0-4范围内，通常在范围内，通常在4 下下。低温条件对酶不仅溶解度降低，而且酶不易变性。低温条件对酶不仅溶解度降低，而且酶不易变性。(5)pH pH是酶结晶的一个重要条件有时只相差是酶结晶的一个重要条件有时只相差0.2pH单位时，单位时，只能得到沉淀，而得不到结晶

36、，所选择只能得到沉淀，而得不到结晶，所选择pH应在酶的稳定范围应在酶的稳定范围内，内，般选择在被结晶酶的般选择在被结晶酶的pI值附近。值附近。为了获得某种酶蛋白的结晶，往往需要进行一些适当的预备为了获得某种酶蛋白的结晶，往往需要进行一些适当的预备实验摸索。实验摸索。(6)金属离子金属离子 许多金属能引起或有助于酶的结品。不同酶选用不许多金属能引起或有助于酶的结品。不同酶选用不同金属离子，在酶结晶过程中常用同金属离子，在酶结晶过程中常用Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+等金属离子。在许多情况下，这些等金属离子。在许多情况下，这些离子是酶表现活力所必滞的

37、，它们能保持酶分子结构上的一离子是酶表现活力所必滞的，它们能保持酶分子结构上的一些特点。些特点。(7)其他其他 除上述因素外，还有一些因素会影响结晶的形成。比如除上述因素外，还有一些因素会影响结晶的形成。比如：需防霉，在结晶过程中不得有微生物生长，一般在高盐浓：需防霉，在结晶过程中不得有微生物生长，一般在高盐浓度或有乙醇时，可以防止微生物生长，在低离子强度的蛋白度或有乙醇时，可以防止微生物生长，在低离子强度的蛋白质溶液中，易生长细菌和霉菌。为此，所有溶液需用超滤膜质溶液中，易生长细菌和霉菌。为此，所有溶液需用超滤膜或细菌漏斗过滤，加入少量的甲苯、氯仿或吡啶，可以有效或细菌漏斗过滤，加入少量的甲

38、苯、氯仿或吡啶，可以有效地防止微生物的生长。又如，在结晶过程中，一般要防止蛋地防止微生物的生长。又如，在结晶过程中，一般要防止蛋白酶的水解作用。蛋白酶水解作用常引起结晶的微观不均一白酶的水解作用。蛋白酶水解作用常引起结晶的微观不均一性，影响结晶的生成和生长。性，影响结晶的生成和生长。(1)盐析法盐析法 采用一些中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、采用一些中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、乙酸铵、硫酸镁、氯化氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、乙酸铵、硫酸镁、氯化钙、硝酸铵、甲酸钠等，在适当条件下保持酶的稳定性，钙、硝酸铵、甲酸钠等，在适当条件下保持酶的稳定性，慢慢

39、改变盐浓度进行结晶。其中，最常用的是硫酸铵、硫酸慢慢改变盐浓度进行结晶。其中，最常用的是硫酸铵、硫酸钠。一般是将盐加入到比较浓的酶溶液中至溶液呈浑浊为止钠。一般是将盐加入到比较浓的酶溶液中至溶液呈浑浊为止，然后放置，并缓慢增加盐浓度。，然后放置，并缓慢增加盐浓度。(2)有机溶剂法有机溶剂法 酶溶液中滴加某些有机溶剂，如乙醇、丙酮、酶溶液中滴加某些有机溶剂，如乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、乙睛、二氧杂环己环、异丙醇、二甲基亚砜等丁醇、甲醇、乙睛、二氧杂环己环、异丙醇、二甲基亚砜等，也能使酶形成结晶。一般在含有少量无机盐和适宜的，也能使酶形成结晶。一般在含有少量无机盐和适宜的pH条件下，于冰浴中缓慢滴入

40、有机溶剂，并不断搅拌，当酶溶条件下，于冰浴中缓慢滴入有机溶剂，并不断搅拌，当酶溶液微浑浊时，在冰箱中放置几小时后，便有可能获得结晶。液微浑浊时，在冰箱中放置几小时后，便有可能获得结晶。 2.3.3.2 结晶的方法结晶的方法(3)微量蒸发扩散法微量蒸发扩散法 将纯酶溶液装入透析袋，用聚乙二醇吸水将纯酶溶液装入透析袋，用聚乙二醇吸水浓缩至蛋白质含量为浓缩至蛋白质含量为1mg/ml左右，然后加入饱和硫酸铵溶液左右，然后加入饱和硫酸铵溶液到到10饱和度左右，再将其分装于比色瓷板的小孔内，连同饱和度左右，再将其分装于比色瓷板的小孔内，连同饱和硫酸铵溶液放入密封的干燥器内饱和硫酸铵溶液放入密封的干燥器内，

41、再在再在4下静候结晶下静候结晶。(4)透析平衡法透析平衡法 透析平衡法是将酶溶液装入透析袋中，对一定透析平衡法是将酶溶液装入透析袋中，对一定的盐溶液或有机溶剂进行透析平衡，酶溶液可缓慢达到饱和的盐溶液或有机溶剂进行透析平衡，酶溶液可缓慢达到饱和而析出结晶。而析出结晶。(5)等电点法等电点法 酶蛋白在其等电点时溶解度最小，通过改变酶溶酶蛋白在其等电点时溶解度最小，通过改变酶溶液的液的pH可以缓慢地达到过饱和而析出酶蛋白结晶。可以缓慢地达到过饱和而析出酶蛋白结晶。(6)其他方法其他方法 还有气相扩散法、复合结晶法、温度诱导法等。还有气相扩散法、复合结晶法、温度诱导法等。 酶制剂通常有下列四种剂型：

42、酶制剂通常有下列四种剂型：(1) 液体配制剂液体配制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成。这种酶制剂不稳定，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业。且成分复杂，只用于某些工业。(2) 固体配制剂固体配制剂 发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须如用于洗涤剂、药物生

43、产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高。输和短期保存，成本也不高。(3) 纯配制剂纯配制剂 包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。医疗注射酶，还必须除去热较高的纯度和一定的活力单位数。医疗注射酶，还必须除去热源。热源属于糖蛋白，分子量在源。热源属于糖蛋白，分子量在10万以上，是染菌后细菌分泌万以上，是染菌后细菌分泌出来的类毒素。带有这类物质的制剂注射到体内后引起体温升出来的类毒素。带有这类

44、物质的制剂注射到体内后引起体温升高。热原耐热耐酸但不耐碱，对氧化剂敏感。它可用吸附、亲高。热原耐热耐酸但不耐碱，对氧化剂敏感。它可用吸附、亲和层析、改变分离纯化等方法除去。和层析、改变分离纯化等方法除去。(4) 固定化酶制剂固定化酶制剂 具体内容详见酶固定化。具体内容详见酶固定化。 2.3.4 酶的制剂酶的制剂 温度温度 在低温条件下在低温条件下(0-4)使用、处理和保存。有的需更低使用、处理和保存。有的需更低温度，加入甘油或多元醇有保护作用。温度，加入甘油或多元醇有保护作用。 pH与缓冲液与缓冲液 pH应在酶的应在酶的pH稳定范围内，采用缓冲液保存稳定范围内，采用缓冲液保存。 酶蛋白浓度酶蛋

45、白浓度 一般酶浓度高较稳定，低浓度时易于解离、吸一般酶浓度高较稳定，低浓度时易于解离、吸附或发生表面变性失效。附或发生表面变性失效。 氧氧 有些酶易于氧化而失活。有些酶易于氧化而失活。 2.3.5 酶的制剂的保存酶的制剂的保存 酶制剂保存的主要问题是提高酶的稳定性，延长保存期。酶制剂保存的主要问题是提高酶的稳定性，延长保存期。 (1) 影响酶稳定性的因素影响酶稳定性的因素 底物、抑制剂和辅酶底物、抑制剂和辅酶其其作用可能是通过降低局部的能级水作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。 对巯基酶可加入对巯基酶

46、可加入SH-保护剂，如保护剂，如-巯基乙醇、巯基乙醇、GSH（谷胱甘（谷胱甘肽）、肽）、DTT（二硫苏糖醇）等。（二硫苏糖醇）等。 其他如其他如Ca2+能保护能保护-淀粉酶，淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，能稳定溶菌酶，Cl-能稳定能稳定透明质酸酶透明质酸酶，其其作用机制可能是防止酶蛋白肽链延展；作用机制可能是防止酶蛋白肽链延展；其次其次是表面活性剂是表面活性剂，如许多酶配置于，如许多酶配置于1的苯烷水溶液中，即使在的苯烷水溶液中，即使在室温下催化活力也能维持相当长时间；室温下催化活力也能维持相当长时间；再次是高分子化合物再次是高分子化合物，如血清蛋白、多元醇等，特别是甘油和蔗糖是近年来低温，如

47、血清蛋白、多元醇等，特别是甘油和蔗糖是近年来低温保存添加剂。保存添加剂。此外，在某些情况下，丙醇、乙醇等有机溶剂此外，在某些情况下，丙醇、乙醇等有机溶剂也显示一定的稳定作用。为了防止微生物污染酶制剂，加入也显示一定的稳定作用。为了防止微生物污染酶制剂，加入一定浓度的甲苯、苯甲酸和百里醇等。一定浓度的甲苯、苯甲酸和百里醇等。 (2) 为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂的小分子物质降至最低，如右的小分子物质降至最低，如右图。图。超滤装置示意图超滤装置示意图超过滤超过滤 (Ultrafiltration) 是是利用压力或离心力强行使溶质利用压力或离心力强行使溶质按分子量

48、、形状、大小的差异按分子量、形状、大小的差异，所需溶质分子阻留在膜的一，所需溶质分子阻留在膜的一则，而小分子溶质则随溶剂透则，而小分子溶质则随溶剂透过膜压到另一侧，这样使大小过膜压到另一侧，这样使大小溶质分子得到分开。所以它的溶质分子得到分开。所以它的持点是利用有选择透过的多微持点是利用有选择透过的多微孔膜，在液压作用下，分离出孔膜，在液压作用下，分离出大分子溶质（右图）。大分子溶质（右图）。实验室内常用的超滤装置有以下几种：实验室内常用的超滤装置有以下几种：(1) 中空纤维超滤器中空纤维超滤器中空纤维超滤装置是将成束的中空纤维中空纤维超滤装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。当轴流通过

49、管腔时，造成高剪切力装入一筒内，两端封闭。当轴流通过管腔时，造成高剪切力，在截留溶质分子的同时，将浓度降至最低限度。每根中空，在截留溶质分子的同时，将浓度降至最低限度。每根中空纤维内腔直径为纤维内腔直径为0.2mm,中空纤维由惰性的非离子聚合物制成中空纤维由惰性的非离子聚合物制成具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维表面积大，超滤具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维表面积大，超滤流量大、阻留溶质的浓度范围为流量大、阻留溶质的浓度范围为4-20左右。如下图所示。左右。如下图所示。a 超滤过程；超滤过程；b 浓缩透析仪浓缩透析仪 封闭式超滤装置封闭式超滤装置封封闭式超滤装置有搅拌和闭式超滤装置有搅拌

50、和不带搅拌的两种。搅拌不带搅拌的两种。搅拌型超滤器带有磁力搅拌型超滤器带有磁力搅拌或机械振动，借助搅拌或机械振动，借助搅拌或振动造成高液流从而或振动造成高液流从而控制浓度极性，溶质浓控制浓度极性，溶质浓度一般为度一般为5%（图（图a)；无搅拌型超滤器也有多无搅拌型超滤器也有多种形式，如用惰性气体种形式，如用惰性气体推动柱塞迫使溶液过滤推动柱塞迫使溶液过滤的叶柱塞推进式加压超的叶柱塞推进式加压超滤器（图滤器（图b)，由于它无，由于它无搅拌，没有控制浓度极搅拌，没有控制浓度极化，而只能处理小体积化，而只能处理小体积的溶液，溶质浓度的溶液，溶质浓度1%。 循环型超滤器循环型超滤器这种超滤装置浓缩大溶

51、质的浓度可这种超滤装置浓缩大溶质的浓度可达达40，同时，可用于大溶质的分离。这是一种带有，同时，可用于大溶质的分离。这是一种带有浅道的超滤装置。它使液体在浅道中奔流，从而使其浅道的超滤装置。它使液体在浅道中奔流，从而使其具高剪切力稳定的层流，将浓度极化下降到最低。具高剪切力稳定的层流，将浓度极化下降到最低。离心机轴半径示意图离心机轴半径示意图若已知半径及转速，可求得相对离心力（右图）。颗粒的沉降速度不仅取决于应用的离心力的大小，而且，还取决于颗粒的密度()、半径(r)和溶液的密度(0)与黏度(g/cm.s)。这样颗粒下降至管底的时间(t)为：Xt为液面的轴半径距离(cm), Xb为器底的轴半径

52、距离(cm)依上述，不同大小球状颗粒下降至器底时间不同，有先有后，一般重量大大小、轻重可将酶分离出来。离心分离只能把各种下的沉降速度亦大，体积大的沉降速度小，这样按照分子降物或不溶物与溶液分开，无法把分子量、性质、结构相近的大分子细分，但内于其容量大、需时短，在分离酶时常用到。2209ln2btXtXr2.4.3 凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤 (Gelfitration) 即凝胶过滤层析即凝胶过滤层析 (Gelfitration Chromatography)，也称分子排阻层析，也称分子排阻层析 (Molecular-Exclusion)、分子筛层析、分子筛层析(Moleculai-Sie

53、ve Chromatography)，是根据分子，是根据分子大小分离纯化酶最有效的方法之一大小分离纯化酶最有效的方法之一 (下图下图)。在层析柱中填充分子筛（凝胶）介质，加入待纯化样品，在层析柱中填充分子筛（凝胶）介质，加入待纯化样品，然后用适当的缓冲液淋洗，使样品自上而下扩展。大于凝胶孔然后用适当的缓冲液淋洗，使样品自上而下扩展。大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间间隙扩展，下移速度较径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间间隙扩展，下移速度较快；反之，小于凝胶孔径的分子，能自由出入胶粒内外，按照快；反之，小于凝胶孔径的分子，能自由出入胶粒内外，按照分于热运动规律，其运动轨迹分于热运动规律

54、，其运动轨迹“迂回曲折迂回曲折”。因此，下移速度。因此，下移速度慢。所以，样品通过一定距离的层析柱后，不同大小的分子就慢。所以，样品通过一定距离的层析柱后，不同大小的分子就将按先后顺序依次流出，彼此分开。将按先后顺序依次流出，彼此分开。为使胶过滤达到理想效果，需考虑如下因素：为使胶过滤达到理想效果，需考虑如下因素：2.4.3.1 凝胶选择凝胶选择 最常用的凝胶有以下几种：最常用的凝胶有以下几种：(1)葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可分离分子量从丙烷交联而成的网状结构物质，可分离分子量从100

55、0-500000的的分子。其商品名是分子。其商品名是Sephadex G，有各种型号，有各种型号 (下表下表)，G后的数字后的数字表示每表示每g干胶吸水量干胶吸水量 (即吸水值即吸水值) 的的10倍，其特性如下表所示。另倍，其特性如下表所示。另外还有一种为外还有一种为Sephacyl-S，通过，通过N,N-甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖，可适用于水、有机溶剂及高浓度解离试剂存在的系统基葡聚糖，可适用于水、有机溶剂及高浓度解离试剂存在的系统。另一类。另一类Sephadex-LH，适用于脂类化合物的分离。，适用于脂类化合物的分离。类型类型颗粒直径颗粒直径(m)工作范围工作

56、范围吸水值吸水值(mg/g 干胶干胶)床体积床体积(mg/g 干胶干胶)膨胀时间膨胀时间(h)球状球状(Mw)线状线状(Mw)20100 G-1040-120200 700 10.22-331 G-1540-120150 15001.5 0.22.5-3.531 G-25300-101000-6000100-50002.5 0.24-662 G-50300-101500-30000500-300005.0 0.39-1162 G-75120-1030000-700001000-500007.5 0.512-15243 G-100120-104000-1500001000-100000 10 1

57、15-30485 G-150120-105000-4000001000-15000015 1.520-30725 G-200120-105000-8000001000-200000 20 230-40725型号型号颗粒颗粒数目数目颗粒直径颗粒直径 (m)工作范围工作范围(Mw)吸水值吸水值(mg/g 干胶干胶)床体积床体积(mg/g 干胶干胶)溶胶时间溶胶时间(h)20沸水浴沸水浴P-250-400150-40200-20001.532-42P-450-400150-40800-40002.44.82-42P-50-400150-401000-60003.77.42-42P-1050-4001

58、50-401500-200004.59.42-42P-3050-400150-402500-400005.711.410-123P-6050-400150-403000-600007.214.410-123P-10050-400150-405000-1000007.515.4245P-15050-400150-4015000-1500009.718.4245P-20050-400150-4030000-20000014.729.4435P-30050-400150-4060000-40000018.036.0485类型类型颗粒直径颗粒直径 (m)工作范围工作范围琼脂浓度琼脂浓度 (%) 6B4

59、0-2101104 41066 4B40-19010421074 2B50-25010421072 A0.5m1040.510610 A1.5m50-10050种种)需要核苷需要核苷酸的酶、清蛋白、酸的酶、清蛋白、2-巨球巨球蛋白、干扰素蛋白、干扰素游离辅助因子如游离辅助因子如NAD+(0-0.2mol/L); 升高离子强度升高离子强度(0-1mol/L NaCl); 降降低或升高低或升高pH5-AMP 或或 2,5-ADPNAD+ 类似物类似物NADP+需需NAD(P)+的脱氢酶、需的脱氢酶、需ATP的激酶的激酶游离辅助因子如游离辅助因子如NAD+, NAD+(0-0.2mol/L); 升高

60、离子强度升高离子强度(达达1mol/L); 降低或升高降低或升高pH另外，使用一些蛋白质可逆变性剂，如脲、盐酸胍等，在低pH条件下使酶构型发生可逆变化从而解离下来，并很快从酶溶液中除去这些物质。有时采用酶促降解配基或载体，或者其他化学方法来断裂配基-酶间化学键而达洗脱目的。吸附剂再生，一般采用合0.5mol/L NaCl的pH8.5、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液洗至pH8.5，再用含有0.5mol/L的0.1mol/L pH4.5的醋酸缓冲液洗至pH4.5，然后用水洗至中性，用时再用起始缓冲液平衡。2.7.1.4 亲和层析举例（1）亲和吸附剂制备 一般多糖类载体如琼脂糖、葡聚糖、纤