第十章有机高分子

1、HPLC是现在生物分离分析的重要手段，具有分离效率高、选择性好、适应面广（对被分离物质大小、含量、性质和操作方法）、产品纯度高和重复性好等特点。HPLC的核心是在于分离柱填料。HPLC的分类按分离机理：基于吸附分配的反/正相及疏水色谱，基于电荷作用的离子交换、基于空间排阻的凝胶层析/凝胶渗透，基于生物特异作用的亲和色谱等。按填料性质分：有机和无机填料色谱。有机填料的优越性： 以多糖和有机基质骨架，易于改性。 理化稳定性好，耐酸、碱和溶剂，反复使用。 生物相容性好，非特异吸附少。 高负载，高容量。非常适合生物活性分子，有机高分子的刚性普遍不如无机填料，淋洗过程会膨胀或皱缩。一、填料的物理结构填料

2、的色谱动力学受粒度及粒度分布、孔径与孔径分布、粒度强度和表官形态等影响。色谱对填料在物理性质上的要求： 合适的粒度大小和狭窄的粒度分布范围，能单分散最好。 刚性好，一定的颗粒强度，满足高速高压操作要求。若为多孔结构填料，除达到孔径大小和分布外，尽量避免形态复杂的微孔结构。使用时填料融胀/收缩不能超出规定用允许范围。常用HPLC填料按物理形态可分为：1、多孔型 又分小孔30nm; 超大孔100nm。2、非多孔型 整体颗粒无孔。3、薄壳型 内部无孔，表面层为多孔结构。实践上以高负载量的多孔型最常用，特别是大孔和超大孔gel。颗粒大小也各不一样，工业化生产中使用大粒度填料便于操作。上世纪80年代以来

3、，填料研究在一些方面取得了可喜的进步：颗粒单分散填料具贯穿性超大孔结构填料 如贯流色谱填料颗粒含600-800nm贯穿孔，贯穿孔内连接80-150nm的扩散孔。小颗粒非多孔填料 避免了非特异性吸附，效率高时间短。二、填料的化学结构色谱的化学热力学行为决定于其填料化学结构（特别是颗粒外表面和内孔表面化学结构）。既要有选择性分离的化学结构，又要良好的化学和热稳定性以及极低的非特异性吸附。HPLC填料按结构分为：1、离子交换色谱填料 颗粒表面带某种电荷的可交换基团。2、反相色谱填料 颗粒表面含C8、C18烷基/苯基强疏水基团/链段。3、正相色谱填料 颗粒表面含羟基、氨基、羧基醚链等极性基团/链段。4

4、、疏水相互作用色谱填料 颗粒表面含C1、C4烷基、笨基、PEG等弱疏水基团/链段。5、空间排除色谱填料 有亲水和亲油2类，用于水相体系的含羟基的亲水基团；非水相的含疏水基团。6、亲和色谱填料 颗粒表面带特异性配基。对基质材料经过化学修饰，才能制备成合适的色谱填料，满足不同色谱技术的需要。基质材料/载体 是色谱填料的支撑骨架，决定填料的颗粒大小与分布、颗粒强度、孔径大小与分布、孔的结构形态、颗粒内部的化学结构和其稳定性等，也影响对颗粒表面的化学修饰的实施。常见有机高分子类型填料的基质树脂可分为：多糖型 天然多糖原料用物理方法加工成微珠并交联成凝胶。聚合物型 将合成单体/交联剂用化学聚合成交联高聚

5、物微球。一、多糖型基质材料亲水性树脂无须改性可直接用于凝胶过滤色谱1、葡聚糖系凝胶 由葡聚糖和环氧氯丙烷偶联制成。早期的软凝胶系列Sephadex G-x，强度低，粒度分布宽，改进型有高交联羟丙基化葡聚糖 Sephasorb HP Uitrafine 以及烯丙基葡聚糖和甲叉双丙烯酰氨交联共聚凝胶 Sephacryl系列，刚性好，柱压低适合高流速色谱。2、琼脂糖系凝胶 传统的Sepharose，Bio-gel A，Ultragel A软胶系列。改进型Sepharose CL系列， Sepharose Fast Flow， Sepharose High Performance等。二、聚合物型基质材

6、料 比多糖型凝胶的机械强度大，化学性质更稳定，更适合于高速高压的HPLC操作。按结构形态分为多空型和非多空型；按性能分有亲水及疏水凝胶。1、交联聚苯乙烯树脂 苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物微球，Rohmhaas 的AmberliterXAD系列、Hamilton Co. 的PRP-1、 Hitachi gel 3010、3011系列等。具颗粒小而均匀，单分散，贯穿性超大孔的特性。 不改性的这类树脂也可用于色谱操作。2、交联聚甲基丙烯酸酯类树脂以甲基丙烯酸的甲酯、丁酯、羟基乙酯、环氧丙酯等为原料为单体制备的多型高联高聚物微球。Spheron、 Shodex OH pak、Hitachi Gel

7、3020等系列凝胶，具有 良好的亲水性和刚性。3、其他类型树脂TSK gel PW from Toyosoda co.Toyopearl 系列Asahipad GS系列颗粒刚性好，粒度分布范围窄。一、填料物化性质的表征颗粒大小dp（m）与分布 用显微镜观察或粒度分布仪测定。填料比表面积S（m2/g） BET方法测定。BET是三位科学家（Brunauer、Emmett和Teller）的首字母缩写，三位科学家从经典统计理论推导出的多分子层吸附公式基础上，即著名的BET方程，成为了颗粒表面吸附科学的理论基础，简单说就是从BET公式可以计算样品的单层吸附量Vm，再由相关公式算出样品的比表面积。 填料骨

8、架密度g(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、溶胀因子 f 等参数，可用中科院施良和的方法测定。填料的比孔体积Vp(ml/g)，可据Sr、f、g值按公式计算。 Sr=fVp+ （f-1）/ g填料孔度的计算 Vp = Vp +1/g填料孔径大小与分布测定：毛细管聚凝聚法、压汞法及电经法。孔的结构形态可以扫描电镜直接观察，也可行色谱分析或其他性质测量。填料化学结构与性质、pH适应交换容量等用其他常规方法测定。二、填料色谱性能的表征不同色谱方法各有其特定的性能指标，但又包括一些共同的基本参数。1、保留值 tR指样品在填充柱中的滞留时间；若以体积表示即为保留体积。 VR= tRFc 为Fc流动相

9、流速。 扣除不保留物质的流出时间（死时间 t0），得到调整保留值： tR = tR t0 ； VR= VR t0Fc tR tR k = - 1 = t0 t0k即容量因子 ，与固定相流动相性质和柱温有关。2、选择性a表示相邻二物质保留时间的比值 tR2 1+ k2 a = = tR1 1+ k1a与固相种类、 流动相组成及温度有关。3、柱效率以理论踏板数（N）表示 N=5.54（Tr/2t1/2） t1/2 为色谱峰的半高宽。用理论踏板高度表示的柱效为 H = L / N4、填充柱的总孔隙度和穿透性5、分离度R是相邻2色谱峰的保留值之差与各自底峰宽（tW1和tW2）一半之和的比值。是色谱柱分

10、离效能的综合指标。 反相色谱（RPC）是HPLC的分支，目前仍然使用硅胶基质的键合相填料为主的填充材料的色谱柱。其特点是颗粒刚性好利于传质柱效高选择性好pH适应范围2-8之间，不如其他有机填料基质表面的硅羟基可能使蛋白样品失活。保留机理还不清楚，有的认为是分配作用，有的说是吸附作用。 微球形交联聚苯乙烯树脂，是高分子基质的RPC填料，可在广泛的pH1-212-14范围使用，树脂表面有较强的疏水作用。多孔填料应根据被分离物质大小选择合适孔径的填料，除多孔型填料外，非多孔型填料也在RPC中 得到推广使用。 非多孔型填料的特点：粒度小、刚性好、柱效高、分辨率高，特别适合少量和微量样品的分析与分离。教

11、材P194列出了部分RPC填料的参数与特性。利用样品与固相表面基团之间电荷的相互作用达到分离目的。表现为离子离子、偶极与离子间或着其他动态平衡的作用力，有4种交换方式。已非常广泛地应用于分析检测和分离纯化的操作手段。特点：pH适应广、使用寿命长、大容量、低非特异性吸附一、多糖基质的IEC层析介质基质骨架为葡聚糖、琼脂糖或钎维素构成，有良好的亲水性和生物相容性，容量大，价格低。随着制备技术发展，一些颗粒强度和均匀性更好的高度联多糖类凝胶不断涌现，在保持原有类型介质优点的同时，也能在适当压力和较高流速下操作。教材P197表10-2列出了部分多糖基质IEC介质的特性。二、聚合物基质的高效IEC填料常

12、见的有以交联共聚的苯乙烯-二乙烯为基质或其他交联高聚物基质填料。按所带基团分为：强碱性阴离子型（含季胺盐）弱碱性阴离子型（伯、仲氨基）、强酸性阳离子型（磺酸基）、 弱酸性阳离子型（羧基），具体参见教材P198表10-3的内容。1、多孔树脂的IEC填料以多孔交联聚苯乙烯微球为基质，代表了今年来高效IEC填料新的发展水平。在柱效、分离度、负载量和回收率等方面性能卓越。Mono Beads、SOURCE、POROS三类系列产品。大孔亲水性高聚物羟基化聚醚凝胶为基质的IEC填料，目前应用也很广，是在原有亲水凝胶过滤色谱填料的基础上发展而来的。如TSK gel DEAE-5pw、SP-5PW、CM-5P

13、W等。粒度小、大孔径、中等交换容量。以亲水性大孔交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯微球为基质的IEC填料，也占有重要地位。2、非多孔树脂的IEC填料主要包括亲水性 高聚物即羟基化聚醚、交联聚苯乙烯、交联聚甲基丙烯酸酯及交联琼脂糖等。表面结构与多孔性型产品类似。粒度小（几微米），颗粒均匀、刚性好、穿透力强、流速适应范围广、低负载量、避免溶质在固相内部的吸附与扩散。如 TSK gel DEAE-NPR、SP-NPR等。对改善柱效、提高分离回收率、保持大分子生物活性非常有利。但对分子量小于1000的小肽混合物，效果不令人满意。用于分离寡核苷酸效果很好，常用于核酸合成的的处理。IEC在快速分离分析和微量样品分离

14、检测与制备中有广阔的前景。3、薄壳型树脂的PEC填料在HPLC发展初期时比价盛行，一定程度上坚固了多孔和非多孔填料的部分优点，现在逐渐被多孔和非多孔填料代替了。三、高聚物型离子色谱填料离子色谱产生于上世纪70年代中期，依赖高灵敏的电导检测器、高柱效低交换容量分离柱填料及消除淋洗背景离子干扰技术的进步。能够快速灵敏低测定各种痕量的阴阳离子型物质。常见的IC有单柱系统和双柱系统2类。单柱系统将分离柱直接与检测器连接；双柱系统在分离柱与检测器之间连接有消除本底电导信号的抑制系统。双柱系统填料如Dionex的AS系列（阴离子分析柱）和CS系列（阳离子分析柱），均是以交联聚苯乙烯为基质的具有薄壳结构的离

15、子 交换剂。单柱系统填料为低交换容量的多孔性离子交换剂，如 TSKgel IC-Anion-PW ，TSK gel-IC-Cation-PW。IC成功解决了痕量阴/阳离子型物质的分析检测难题。疏水性相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography, HIC）指采用适度疏水性的固定相指采用适度疏水性的固定相, , 以含盐的水溶液作为流动相分离生物大分子（如蛋白质）以含盐的水溶液作为流动相分离生物大分子（如蛋白质）键合相色谱方法。键合相色谱方法。为适应生物活性大分子提取，特别是蛋白质提取纯化而发展起来的。原理原理：HIC依赖溶质与填料表面间的弱疏水相互作用

16、实现物质分离纯化。在高盐离子活度溶液中，蛋白质分子疏水部分与填料表面产生疏水性相互作用而被吸附，当淋洗液离子强度下降后，蛋白质按疏水性特征被依次洗脱下来，疏水性越强，洗脱时间越长。特点：采用高盐进样，中性或接近中性的盐水溶液洗脱, 样品的生物活性高，蛋白质纯度高，高回收率，成本低等。疏水色谱中无机盐的作用与盐析沉淀蛋白质的作用十分相似。或经亲水性处理的有机高聚物有机高分子 类型HIC填料组成：通常以亲水性凝胶微球为基质，表面再经过化学修饰引入疏水性基团/链段的的树脂。填料材料的选择：基质可以是多糖，也可以是高聚物微球。拟选择的基质可以是多孔结构（大孔/超大孔）或非多孔结构，有机高聚物微球应在连

17、接官能团之前做疏水性处理。教材P206-7之表10-4列出了部分有机高分子HIC填料的特性。常见HIC填料的疏水基团的疏水性强弱，依官能团的不同而不同，一般地苯基辛基丁基异丙基醚链。同时，疏水基团的结构和密度是影响生物样品保留值和色谱柱负载量的主要因素。多孔型和非多孔型结构的HIC填料，几十mg/ml树脂，如Toyopearl 10-50mg/ml, Macrosphere gel 13-110mg/ml。洗脱方式：高盐吸附，低盐洗脱。常用硫酸胺 （与IEC比较？）产品检测：光度检测；电导检测；生化检测光度检测；电导检测；生化检测图 蛋白质在疏水柱和反相柱上的分离比较蛋白质在疏水柱和反相柱上的

18、分离比较1 细胞色素细胞色素 C 2 肌红蛋白肌红蛋白 3 溶菌酶溶菌酶TSK 5PW硫酸铵从硫酸铵从1.7减少到减少到0.1mol/LRP-304乙腈从乙腈从0增增加到加到100%空间排阻色谱（size exclusion chromato- graphy,SEC）根据溶质分子尺寸根据溶质分子尺寸(分子量、有效分子量、有效体积、流体力学体积体积、流体力学体积)的差别进行分离的。主要的差别进行分离的。主要应用于高分子化合物和聚合物的分子量分布测定，应用于高分子化合物和聚合物的分子量分布测定，在生物化学和材料科学领域中得到广泛的应用。在生物化学和材料科学领域中得到广泛的应用。与液相色谱液相色谱根

19、据样品组分在固定相和流动相之间根据样品组分在固定相和流动相之间的平衡分配系数差别，的平衡分配系数差别， 造成不同的移动速度而造成不同的移动速度而达到分离的机制不同。达到分离的机制不同。 SEC方法包括包括:1、凝胶过滤色谱、凝胶过滤色谱(GFC):,以水为流动相以水为流动相2、凝胶渗透色谱、凝胶渗透色谱(GPC): 以有机溶剂为流动以有机溶剂为流动该方法能简便迅速分离分离大小差异较大的组分。该方法能简便迅速分离分离大小差异较大的组分。非常适合分析样品组分分布情况，以及纯化的最非常适合分析样品组分分布情况，以及纯化的最后脱盐等操作。后脱盐等操作。一、一、SEC填料的一般特性与色谱指标填料的一般特

20、性与色谱指标填料的结构和性质必须与淋洗体系相匹配，不能填料的结构和性质必须与淋洗体系相匹配，不能与试剂和溶质分子发生任何基团间的的相互作用，与试剂和溶质分子发生任何基团间的的相互作用，将尽可能避免非空间排阻效应（吸附、离子交换、将尽可能避免非空间排阻效应（吸附、离子交换、分配层析）。物理结构上粒度均匀，孔径均匀而分配层析）。物理结构上粒度均匀，孔径均匀而分布窄，还需要光洁的表面，规整而通畅的孔结分布窄，还需要光洁的表面，规整而通畅的孔结构形态，较大的孔度及适当的孔径大小与分布。构形态，较大的孔度及适当的孔径大小与分布。SEC填料的色谱表征，除了柱效、选择性、分离度、穿透性外，还需满足下面的要求

21、：1、排除极限表示填料可用来分离物质大小的最大极限，超过该极限物质就从填料颗粒间隙穿过而没有分离效果。排除极限取决于填料的最大有效孔径。2、分离范围表示填料能物质分子量的范围，分子量高于或低于此范围的物质分别被排除或渗透而不能分离，它取决于有效孔径的分布范围。3、固流相比指填料有效孔内体积与填料颗粒间隙体积的比值，比值越大越好。反应柱子的分离容量，紧密填充时，比值与填料孔度有关。二、凝胶渗透色谱填料凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography, GPC) 分离对象一般是酯溶性的物质，相应的填料是疏水性的，常用有机溶剂淋洗体系。影响色谱行为的主要因素是填料颗粒内部高聚

22、物超微结构离子堆积的不均一性而使多孔骨架弯曲，产生阻碍的作用，所以致孔技术非常重要。高分子类型的GPC填料主要是交联共聚苯乙烯-二乙烯苯多孔微球。按孔径大小和致孔方式不同分结构均匀填料 单纯由交联网络所决定的，孔径均匀，透明状。结构半均匀的填料 用良溶剂致孔而聚合的，半透明状。结构非均匀的填料用非良溶剂致孔而聚合的，聚合反应一开始就产生相分离，形成由交联聚合体小颗粒堆积而成的大孔，呈乳白色。很多这类填料以商业化，-Spherogel系列;Shodex GPC-A, -H,-KF系列;TSK gel-H,HXLX系列等三、凝胶过滤色谱填料凝胶过滤色谱(gel filtration chromat

23、ography,GFC)用水相淋洗体系，将物质按分子大小分离。传统GFC填料通常是软胶，主要有葡聚糖凝胶；琼脂糖凝胶；聚丙烯酰氨凝胶。其特点是粒度分布范围宽；强度低；分离速度慢，不能承受较大压力；亲水性好；生物相容性好。1、多糖型GFC填料在传统sephadex、Sepharose基础上发展出高交联的多糖型填料。理化性能和指标有明显改进与提高。具有良好的机械强度和化学稳定性，粒度分范围窄，可在适当压力和较高流速下操作，能经受酸碱清洗和广泛pH的溶液。部分用于高效GFC填料，在FPLC，HPLC系统用于分析分离和半制备分离。部分多糖型填料及其特性见书P211-2，表10-5、6。 应用应用Sep

24、hadex G-75Sephadex G-75纯化的包涵体蛋白纯化的包涵体蛋白2、高聚物型GFC填料以多孔高聚物微球为基质。机械强度比多糖型更好，粒度分布更窄，甚至达到单分散水平；但亲水性和生物相容性不及多糖型填料，通过改性能改善之。按类型分有带亲水基团的多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂交联聚乙烯醇树脂被亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂羟基化聚醚类亲水性树脂等。特点：粒度小而均匀；机械强度高；适宜的孔径大小与分布；良好的亲水性和化学稳定性；交好的生物相容性等。部分高聚物型GFC填料特性见书P213表10-7亲和色谱(affinity chromatography, AFC)利用生物分子间特异性相互作用

25、的分离方法。专一性强。原则上讲只要在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，就可以建立一种亲和色谱方法，用于分离与之配对的物质。AFC的特点是高度专一性和选择性，活性回收率高。有机高分子类型的AFC填料，按基质材料分有：多糖型高聚物2类。按配体性能（填料所带配体对被分离物质的选择性）分有专用性通用性2类。专用性填料基于配体和被分离物质（Ag-Ab,激素-受体）间的特异性作用，所以有很高的特异选择性和亲和力。通用性填料配体可与多种物质结合，故选择性不强，专一性不高。但配体比较廉价且容易获取，在AFC色谱中仍居主导地位。常见的通用性亲和配体有金属螯合物配体小分子类配体：AA、肽、肝素等颜料类配体：Cibacron兰、Procion红等外源性凝聚素类配体：conA、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素等核酸与核苷酸累配体：AMP、PolyA、PolyU等。从亲和配体连接方式看有两种从亲和配体连接方式看有两种配体与基质直接偶联配体与基质直接偶联间间接偶联接偶联在配体与基质间插入一适当长度的；链状间在配体与基质间插入一适当长度的；链