第六章酶工程

1、 物理吸附法物理吸附法 静止法静止法 电沉积法电沉积法 反应器上直接吸附法反应器上直接吸附法 混合浴或振荡浴吸附法混合浴或振荡浴吸附法 离子结合法离子结合法 含有离子交换基团的固相载体含有离子交换基团的固相载体 第一个离子结合法固定化酶：第一个离子结合法固定化酶：DEAE Cellulose固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶：第一个工业化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶u凝胶包埋法凝胶包埋法首先被采用的首先被采用的凝胶凝胶包埋法是：包埋法是： 固定化胰蛋白酶固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 淀粉酶淀粉酶Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺甲叉双丙稀酰

2、胺, , 丙稀酰胺丙稀酰胺引发剂inactiation双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间得到一种分子间交联的固定化酶交联的固定化酶酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子酶分子 （a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶（固定化酶（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体

3、上形成水不溶性的固定化酶抗体酶抗体酶 或催化抗体（或催化抗体（Catalytic antibody)Catalytic antibody)是一是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。效催化能力巧妙结合的产物。1. 1. 与天然酶相比抗体酶的特点与天然酶相比抗体酶的特点l 能催化一些天然酶不能催化的反应能催

4、化一些天然酶不能催化的反应l有更强的专一性和稳定性有更强的专一性和稳定性l催化作用机制不同催化作用机制不同2. 2. 抗体酶和非催化性抗体作用的比较抗体酶和非催化性抗体作用的比较l 更高的反应特异性更高的反应特异性l反应的可逆性反应的可逆性l反应的量效性反应的量效性l 反应过程反应过程1 1、过渡态理论与抗体酶、过渡态理论与抗体酶2 2、抗体酶催化的三种重要反应机制、抗体酶催化的三种重要反应机制 水解作用机制水解作用机制 基团转移基团转移 连续反应机制连续反应机制3 3、抗体酶催化反应的介质效应、抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中具稳定性。抗体

5、酶在有机溶剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应脱羧反应中介质效应 ：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性较高。：在疏水溶剂中，活性较高。1. 1. 转酰基反应转酰基反应2. 2. 水解反应水解反应3. Claisen3. Claisen重排反应重排反应4. 4. 酰胺合成反应酰胺合成反应5. Diels-Alder5. Diels-Alder反应反应6. 6. 转酯反应转酯反应7. 7. 光诱导反应光诱导反应8. 8. 氧化还原反应氧化还原反应9. 9. 脱羧反应脱羧反应10. 10. 顺反异构化反应顺反异

6、构化反应1. 1. 细胞融合法：用设计好的半抗原，通过细胞融合法：用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对此抗原进行免疫，使联制成抗原。然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体。体。2. 2. 抗体结合位点化学修饰法抗体结合位点化学修饰法：抗体酶和酶

7、一抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。点。3 . 3 . 引入辅助因子法引入辅助因子法 很多天然酶活性中心都含有金属离子。很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lern

8、erLerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺的选择性水解。他们用三乙撑胺CoCo3+3+盐作为金盐作为金属离子辅因子，所用半抗原分子带有一肽键。属离子辅因子，所用半抗原分子带有一肽键。且通过羧根及仲胺基与金属离子相连。将此半且通过羧根及仲胺基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键之间的

9、肽键 . .抗原和抗体抗原和抗体 当外源物性物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋当外源物性物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白动物体内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白（immune globinimmune globin），并以之结合，以消除异物的毒害。），并以之结合，以消除异物的毒害。此反应称为免疫反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是此反应称为免疫反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体抗体。5. 5. 拷贝法拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗

10、体，：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。抗体酶。6. 6. 共价抗原免疫法共价抗原免疫法 这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗体酶制备方法。以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合体酶制备方法。以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团，如亲核部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团，如亲核性，亲电性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。性，

11、亲电性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。五、抗体酶的筛选五、抗体酶的筛选1 1. ELISA. ELISA法；用法；用ELISAELISA法筛选对半抗原有亲和力的单克法筛选对半抗原有亲和力的单克隆抗体隆抗体 。2. 2. 酶学活性检测法酶学活性检测法：直接用反应底物检测细胞培养液中：直接用反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性。抗体的酶活性。3. 3. 短过渡态类似物法：短过渡态类似物法：以过渡态类似物中含有的必需基以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。4. 4. 基因筛选法基因筛选法 ：应用基因探针，对基因抗体库进行分应

12、用基因探针，对基因抗体库进行分析和筛选。析和筛选。六、抗体酶的应用前景六、抗体酶的应用前景 在有机相合成在有机相合成 用于阐明化学反应机制用于阐明化学反应机制 在医疗上的应用在医疗上的应用2.抗体酶用于肿瘤治疗 目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。当瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。当然交药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，然交药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性抗原还要尽量减少免疫原性 。 免疫球蛋白免疫球蛋白IgG的一级结构的一级结构IgG的三级结构的三级结构IgG与抗原形成与抗原形成 的交联晶格的交联晶格酶联免疫分析酶联免疫分析将酶作为标记物质，使之和抗原