南方医科大学细胞生物学第二章研究方法

1、第一节第一节 显微镜技术显微镜技术 光学显微镜光学显微镜 : : 观察显微结构观察显微结构 （light microscope)light microscope)显微镜显微镜 电子显微镜电子显微镜 : : 观察亚微结构观察亚微结构 (electron microscope) (electron microscope) 第二章第二章. .细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法分辨率公式分辨率公式n = 介质折射率（空气介质折射率（空气1，水，水1.33，香柏油，香柏油1.5）= 标本对物镜镜口张角的半角，标本对物镜镜口张角的半角， sin的最大值为的最大值为1。= 照明光源的波长，白光照明光源的波

2、长，白光0.5 m 。横向分辨率横向分辨率 Rx,y=0.61/nsin 纵向分辨率纵向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页( (一一) )普通光学显微镜的分辨率：普通光学显微镜的分辨率：0.2微米微米一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术思考：思考：如何提高显微如何提高显微镜的分辨能力？镜的分辨能力？人眼的分辨率：人眼的分辨率：100 m不同光线的波长不同光线的波长名名 称称 波波 长长 (nm) 可见光可见光 760 -390 紫外光紫外光 390 -13 X 射线射线 13-0.05 射线射线 1-0.005 电子束电

3、子束 : 100V 0.123 10,000V 0.0122 100,000V 0.00387 （二）普通光学显微镜的成像原理（二）普通光学显微镜的成像原理 光镜的结构光镜的结构 光学部分光学部分 照明部分照明部分 机械部分机械部分在普通光学显微镜下，细胞结构呈在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状半透明状，不易看清。，不易看清。往往将标本切片往往将标本切片进行进行染色染色提提高可辨程度高可辨程度。切片机切片机染染色色的的原原理理以以紫外线紫外线为光源，照为光源，照射被检物体发出能观射被检物体发出能观察到的荧光。察到的荧光。荧光显微镜显示同一细胞中的多种结构成分荧光显微镜显示同一细胞中的多种结

4、构成分细胞核内质网细胞骨架通过致密部分通过致密部分( (如细胞核如细胞核), ),速度慢速度慢通过疏松部位通过疏松部位( (如细胞质如细胞质), ),速度快速度快倒置相差显微镜倒置相差显微镜载物台的上方：载物台的上方： 光源光源 长焦距长焦距聚光器聚光器载物台的下方：载物台的下方： 物镜物镜应用：直接对培养的应用：直接对培养的 细胞进行观察细胞进行观察体外培养的细胞(a)：正在分裂生长的Hela 细胞(b)：CHO单层细胞的培养 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图

5、像。体图像。信噪比信噪比 英文名称：英文名称：signal-to-noise ratio;signal to noise ratio定义定义： 特定参数特定参数( (信号信号) )值与非特异性参数值与非特异性参数( (噪噪声声) )的比值。的比值。 如实验中样品的放射性与本底放射性如实验中样品的放射性与本底放射性强度之比；荧光在强度之比；荧光在X X射线底片上所造成的感射线底片上所造成的感光强度与非特异感光背景强度之比等光强度与非特异感光背景强度之比等二、电子显微镜二、电子显微镜1.1.透射电子显微镜透射电子显微镜分辨率分辨率= = 0.1 nm2.2.扫描电子显微镜扫描电子显微镜-显示细胞显

6、示细胞表面表面三维立三维立体结构体结构显示细胞显示细胞断面断面三维立三维立体结构体结构电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较显微镜显微镜分辨本分辨本领领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光可见光（400-700） 紫外光紫外光（约（约200nm)电子束电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜电磁透镜不要求真空不要求真空不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光利用样品对光的吸收形成明的吸收形成明暗反差和颜色暗反差和颜色变化变化利用样品对电利用样品对电子的散射和透子的散射和透射形成

7、明暗反射形成明暗反差差一一. .细胞组分的分级分离细胞组分的分级分离 第二节第二节. .细胞生物学其他研究方法细胞生物学其他研究方法分离不同类型细胞 大小大小 密度密度 形状形状 小小 轻轻 不规则不规则 大大 重重 圆形圆形1.1.差速离心法差速离心法 方法：方法：从高速到低速逐级沉降从高速到低速逐级沉降 分离对象：分离对象：体积、质量差别较大的颗粒体积、质量差别较大的颗粒二二 细胞培养细胞培养（一）细胞培养（一）细胞培养 从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存的一种方法。理环境，使之能够继续生存的一种方法。（二）分类（二）分类 原代培养原代培养传代培养传代培养体外培养的细胞(a)：正在分裂生长的Hela 细胞(b)：CHO单层细胞的培养三、细胞融合（细胞杂交）三、细胞融合（细胞杂交）1.1.概念：在自发或人工诱导下，概念：在自发或人工诱导下，相同或不同基因型细胞之间相互相同或不同基因型细胞之间相互融合的过程。融合的过程。2.2.诱导因子：生物：仙台病毒诱导因子：生物：仙台病毒 化学：聚乙二醇化学：聚乙二醇 物理：电脉冲物理：电脉冲3.3.分类：分类： 异核体：异核体：不同基因的细胞核融合不同基因的细胞核融合 同核体：同核体：相同基因的细胞核融合相